酶标仪利用”无创”技术检测活细胞荧光蛋白
简介
在过去的五年中，荧光蛋白在监测体内生物学研究中，起到越来越重要的作用。源于维多利亚多管发光水母中的绿色荧光蛋白(GFP)是最早被我们应用的荧光蛋白，但是随着时间的推移，现在我们可以使用的荧光蛋白种类也越加丰富，包括加强型的变异GFP蛋白、从其他种类水母中发现的荧光蛋白和珊瑚礁蛋白。它们都可以在众多的细胞和组织中被克隆复制，从细菌到酵母，从植物到哺乳动物。这些荧光蛋白稳定、细胞毒性小、而且不需要额外的辅助也能在体内产生可见的荧光。因此，它们可以被用作分子靶标或者独立的报告因子去视化、追踪和定量多种不同的细胞进程，包括细胞合成与代谢，蛋白转运，基因诱导和细胞谱系。不同的荧光蛋白具有不同的颜色，因此也可被用于多重检测。这些荧光蛋白都能被荧光显微镜和流式细胞仪检测到。但是相应的，如果我们不做细胞分选或监测细胞内迁移，微孔板荧光读板仪将是一个更好、更方便和更高通量的检测系统。下面，我们将会向大家展示Molecular Devices酶标仪如何利用”无创”技术检测活细胞荧光蛋白。
我们将从BD Biosciences Clontech公司获得的三株HEK-293细胞系进行不同荧光蛋白的稳定转染。这次研究的目的：1）优化三株细胞系的波长设置，2）通过稀释细胞系来确定检测下限LLD，3）证明在一种细胞系中识别另一种细胞系的可行性。
材料：
HEK-293细胞系稳定表达三种荧光蛋白：
AcGFP---多管发光水母中产生的另一种GFP(但不同于维多利亚水母)
ZsGreen---与GFP相似，但更亮(来自珊瑚礁)
DsRed---一种来自珊瑚礁的红色荧光蛋白非转染的HEK-293细胞系，作为对照
方法：
细胞准备与分析
细胞都培养在大烧瓶中，应用含10% FBS+ 1% Pen/Strep/L-glutamine +500 μg/mL G 418的DMEM的培养基。没有转染的HEK-297细胞作为对照。在实验前一夜，对细胞进行胰酶消化，然后进行密度梯度稀释，最终密度范围为从500,000到100个细胞每毫升。然后把它们过夜接种到96孔(100ul)和384孔(25ul)板中。因此，接种的细胞密度就是50,000到10个细胞每孔(96孔板)和12,500到2.5个细胞每孔(384孔板)。每个稀释都做12个重复。第二天分别用SpectraMax M5和Gemini EM两台仪器对酶标板进行底读和顶读检测。
波长优化
SpectraMax M5和Gemini EM都是基于单色器的扫描式荧光读板仪。针对每一个特殊荧光染料，其激发波长和发射波长都可以在背景之上进行信号优化，这点也是滤光片式酶标仪所不具备的。总的来说，优化策略就是：用低于理论最大激发波长20-25nm的激发光激发，然后初扫发射波长；其次用高于理论最大发射波长20-25nm的发射光扫激发波长。扫描后将给出实际的激发与发射波长。最后可以结合信号/背景分析再做其他额外的扫描来确定最终的结果。（根据斯托克顿位移理论，激发波长应该更低、发射波长应该更高，并且需要一个发射光阻隔滤片来隔离掉非目的波长的光信号）。而且可能还会因为要选择最佳阻隔滤片而再进行两次扫描。
结果：
波长优化
用Gemini EM对DsRed进行波长扫描，以此举例如何进行波长优化。为了检测最大激发波长， 我们首先固定发射波长为600nm，然后对发射波长进行扫描。扫描结果显示最大激发波长为556nm。(图1)同样为了检测最大发射波长，我们固定激发波长为535nm，然后扫描发射波长，从而得到584nm的结果。(图2)激发与发射值都与被发表的波长结果557/579相近。
下一步就是要结合信号/背景优化结果确定最佳激发和发射波长。因为初步检测结果的斯托克顿位移偏小(22nm)，显然是要通过降低激发波长和增大发射波长来扩大两者之间的差异，其次还需要找到合适的发射光阻隔滤片优化最佳灵敏度。最终，我们使用5 5 0nm的激发波长来激发， 同时使用570nm的发射光阻隔滤片隔离掉不想要的高于570nm以上的激发光。通过575到600nm的发射波长扫描DsRed转染的细胞，结果显示在587-588nm处会有峰值出现(图3，上面的曲线)。背景(没有转染的细胞)区域中，点就相对比较平缓(图3，下面的曲线)。基于本次扫描，我们最终优化的设置为550nm激发、588nm发射、575nm作为发射光阻隔滤片。
观察到的最大值与我们建议用于定性分析的设置都总结在列表1中。
细胞稀释的结果
采用底读得到的细胞稀释结果详见图4(96孔板)和图5(384孔板)。顶读结果详见图6(96孔板)和图7(384孔板)。ZsGreen细胞系(上面的曲线)的亮度是其它两种细胞系的将近3.5倍。尽管DsRed细胞系的结果暗于ZsGreen，但两种细胞系的检测灵敏度却相近。(列表2的下图)，因为背景值低于DsRed的波长。
总的来说，图中的点稍微有些非线性，最上方会有一点下降。我们推断是因为细胞在高浓度时，会有贴壁生长的趋势，所以会造成非线性的结果。列表2给出了所有细胞系确认得到的检测下限L L D 。其中L L D 的计算方法是：3SDBLANK/Slope，SDBLANK是背景孔(没有细胞的培养基)的标准差，Slope是曲线底部的斜率。(对于96孔板和384孔板，分别使用了10,000个细胞每孔和2500个细胞每孔的数据)。非转染细胞的RFU信号和标准差结果都与只含有培养基的结果相似。
在本次实验中，ZsGreen和DsRed细胞系在底读模式都有着相似的检测限，而且两者都比AcGFP细胞系的检测下限低3到4倍。本次实验一共重复了三次，但是DsRed实验结果并不是每次都能表现的足够好。在一次实验中，它的检测下限近似于AcGFP，但是在另一次实验中，它的检测下限又会很高。我们将这些区别归结于不同细胞系的通道数目不同。(伴随着一个成功的通道，细胞就会变得越暗)DsRed细胞系在实验开始阶段比其它细胞系长得快，所以在第一次实验中，它比其它细胞系多2-4倍的通道，结果就显然不够理想。
对于AcGFP和ZsGreen细胞系，当采用顶读时，检测下限升高将近三倍。另一方面，对于DsRed，当采用顶读时，检测下限会升高将近10-20倍。我们认为造成这种灵敏度下降的原因在于DMEM培养基有红色荧光信号，会对结果有内部干扰。事实也证明，将培养基换成无色的HBSS，相应的DsRed的顶读结果也会变好。列表3展示了将有色培养基换成无色培养基的结果。底读并没有太多改变(尽管AcGFP的检测下限看起来改善了)，证明这种操作方法并没有导致细胞的损失。然而顶读结果却让灵敏度改善了将近三倍。这些结果也从某一方面支持了一种理论，那就是有色培养基会一定程度上影响顶读的灵敏度。
细胞混合结果
在本次实验中，我们在一个96孔板里混合了多种细胞，保证每个孔大约50,000个细胞。因此，如果是1:1混合，那么每种细胞会有25,000个。如果是1:1:1混合，那么每种细胞将有1 6 , 7 0 0 个。实验板分别用480/510nm(AsGFP和ZsGreen的优化结果)和550/588nm(DsRed设置)的激发和发射来检测。观察到的RFU值与预测值接近。结果总结如下。结果显示，AsGF P和ZsGreen可以和DsRed一起检测，反之亦然。(见图表4)
结论
Molecular Devices公司的荧光读板仪可以检测完整贴壁细胞中的荧光蛋白。波长扫描可调的功能可以优化每一种独特荧光染料的波长结果。底读模式提供最佳检测灵敏度，顶读模式也可以提供可利用的数据，尤其是对含有ZsGreen和DsRed的细胞系。顶读模式检测DsRed细胞系时，可以通过替换无色培养基来达到优化实验结果的目的。