文章亮点

基因组与蛋白组联合分析挖掘关键蛋白基因、iTRAQ定量分析与qPCR共同验证蛋白表达差异、关键蛋白外源表达及功能验证。

NAD（P）H依赖的硫氧还蛋白-二硫化物还原酶TrxR对于芽孢杆菌Y3对亚碲酸盐和亚硒酸盐的还原以及抗逆性是必不可少的

题目：NAD(P)H dependent thioredoxin-disulfide reductase TrxR is essential for tellurite and selenite reduction and resistance in Bacillus sp. Y3

期刊：FEMS MICROBIOLOGY ECOLOGY

影响因子：3.675

合作技术：iTRAQ定量蛋白组学

一、研究背景

Se(IV)和Te(IV)离子的毒性明显强于以固体纳米粒子形式存在的Se(0)和Te(0)，因此利用潜在的微生物还原作用，将环境中的Se(IV)和Te(IV)转化为Se(0)和Te(0)将会大大减轻硒碲离子对环境的污染。在本研究中，作者通过基因组测序和iTRAQ定量蛋白组学分析，在一株高耐受Se(IV)、Te(IV)离子的菌株Y3中挖掘到一个与催化Se(IV)、Te(IV)离子还原相关的潜在关键蛋白TrxR，并通过外源表达验证了该蛋白的功能。

二、技术路线

菌株分离鉴定--菌株对硒碲离子抗性测试--基因组测序、iTRAQ蛋白组定量分析--TrxR蛋白基因表达量qPCR验证--TrxR蛋白外源表达及功能验证--TrxR酶活检测

三、研究结果

1. 菌株Y3筛选与鉴定

作者利用R2A平板培养基从湖北省武汉市某养猪场的废水中分离得到一株对Se(IV)有较强抗性和对Te(IV)有一定抗性的野生型菌株Y3，经16S rRNA测序和NCBI网站Blast比对，并基于该菌的16S rRNA序列构建菌株进化树，鉴定该菌属于芽孢杆菌属Bacillus，并将其命名为Bacillus sp. Y3。该菌对Se(IV)和Te(IV)的最大耐受浓度（250 mM Se(IV)或0.7 mM Te(IV)）明显高于目前报道的具有还原作用的菌株如Comamonas testosterone S44 (Zheng et al., 2014), Lysinibacillus xylanilyticus和 Lysinibacillus macrolides (Zhang et al., 2019a)等等。

2. 菌株Y3对Se(IV)和Te(IV)离子的还原作用

作者将菌株Bacillus sp. Y3分别培养在添加了1 mM Se(IV)或0.5 mM Te(IV)以及同时添加了Se(IV)和Te(IV)的培养基中，培养结果表明单独添加两种物质时，菌株的生长几乎不受影响，且Se(IV)和Te(IV)迅速被还原，在同时添加了Se(IV)和Te(IV)的培养基中，菌株在前期生长被抑制，但是最终的菌体量和菌株对Se(IV)和Te(IV)的还原作用没有受到明显影响。结果表明菌株Bacillus sp. Y3能同时快速地将Se(IV)和Te(IV)还原为Se(0)和Te(0)。

3. iTRAQ定量分析与功能基因挖掘

作者通过对基因组数据进行挖掘分析发现，与催化Se(IV)和Te(IV)还原相关的基因并没有在菌株Y3的基因组中找到，然而，通过武汉金开瑞生物工程有限公司的iTRAQ定量蛋白质组技术对在添加了Se(IV)和Te(IV)条件下培养的菌株进行分析发现，相比于对照组，实验组中大量蛋白质的表达水平存在显著差异，共有157个蛋白表达量显著上调和227个蛋白表达量显著下调，并且发现，具有还原性的谷胱甘肽过氧化物酶和II型延胡索酸酶的表达量分别上调了2.7和2.63倍。有趣的是，通过iTRAQ定量分析发现实验组的硫氧还蛋白-二硫化物还原酶TrxR的表达量被上调了高达18.79倍，另外，通过分析对照组和实验组之间不同的代谢途径，发现菌株Y3的能量合成和硫酸盐代谢途径蛋白的表达受Se(IV)和Te(IV)的诱导，因此，作者认定TrxR蛋白在催化Se(IV)和Te(IV)还原过程中可能起到了关键作用。为了进一步证实TrxR蛋白表达的上调与Se(IV)和Te(IV)的被还原密切相关，作者使用qRT-PCR分析了对照组和添加了Se(IV)和Te(IV)实验组之间细胞内TrxR蛋白基因转录的差异，结果表明，TrxR基因的转录量明显被Se(IV)和Te(IV)上调，上调比例分别为7.8和3.6倍，而当共同添加Se(IV)和Te(IV)时，TrxR基因的转录量更为显著的上调了15.3倍，与蛋白质组学结果相符。

4. TrxR蛋白功能验证

为进一步验证TrxR蛋白对Se(IV)和Te(IV)的还原和抗性功能，作者将该蛋白基因导入到大肠杆菌中外源表达，培养发现，经成功表达了TrxR蛋白的大肠杆菌能在添加了Se(IV)和Te(IV)的培养基中正常生长，而对照组无法在同样的培养基中生长，并且导入TrxR蛋白基因后，大肠杆菌能将培养基中的Se(IV)和Te(IV)还原为Se(0)和Te(0)，验证了TrxR蛋白不仅在Se(IV)和Te(IV)的还原途径中发挥着关键作用，而且增强了大肠杆菌工程菌对Se(IV)和Te(IV)的耐受性。

四、小结

这篇文章对一株野生型菌株Y3进行了基因组测序分析和物种鉴定分析，并通过培养基优化发现该菌对Se(IV)和Te(IV)具有较强的耐受性并且能较快的将Se(IV)和Te(IV)还原成固体形式的Se(0)和Te(0)，从而修复Se(IV)和Te(IV)对环境的污染。通过基因组分析发现菌株Y3基因组中并没有大多数文献报道过的与还原Se(IV)和Te(IV)相关的蛋白基因，而通过iTRAQ定量蛋白组学分析发现与能量合成和硫酸盐代谢途径相关的蛋白受到Se(IV)和Te(IV)的调控，并且TrxR蛋白表达量在有Se(IV)和Te(IV)存在的条件下显著上调，并通过外源表达验证了TrxR蛋白确实在菌株Y3对Se(IV)和Te(IV)的还原过程中起着关键的作用。该文章说明了蛋白组定量能更直观的反映出潜在的作用于关键代谢途径中的蛋白表达量变化情况，蛋白质组学在挖缺关键功能蛋白方面具有基因组和转录组无可比拟的优势。