骨肉瘤 （OS） 是最常见的原发性恶性骨肿瘤，极易转移。OS 可通过淋巴管转移到淋巴结 （LN），肿瘤细胞的转移重建了 LN 的免疫景观，有利于肿瘤细胞的生长。然而，骨肉瘤 LN 转移和转移性淋巴结 （MLN） 微环境重塑的机制尚不清楚。从 18 个单细胞测序样本中，我们获得了 117,964 个细胞。拟时间分析显示，在 LN 转移过程中，成骨细胞 （OB） 细胞可能遵循从癌旁组织 （PC） →原发肿瘤 （PT） → MLN 或从 PC → PT 分化的路径。接下来，结合生生信分析、体外和体内实验以及免疫组化，确定新 ETS2/IBSP 可能会促进 LN 转移。OS 细胞可以通过与各种细胞成分相互作用来重塑 LN 的微环境，例如骨髓、癌症相关成纤维细胞 （CAF） 和 NK/T 细胞。

scRNA‐seq，空间转录组，免疫组化

1. 骨肉瘤单细胞图谱

为了研究发展和转移的过程，本研究收集了 18 份样本，包括 8 例原发性肿瘤 （PT） 、4 例癌旁 （PC） 和 6 例淋巴结 （LN）。此外，为了验证 LN 中微环境的变化，对两个 MLN 进行了空间转录组测序（图 D）。经过数据质量控制，最终获得总共 117,964 个细胞，并将其分为 7 种细胞类型（图 1B）。根据标记基因表达对细胞群进行注释如下：髓样细胞 （LY Z ， S100A9 ， C1QA ， CD68 ， APOE）;T 细胞 （CD3D、CD3E、CD3G、TRAC）;成纤维细胞 （CAF） （FBLN1、ACTA2、TAGLN、COL3A1、COL6A1）;成骨细胞 （OB 细胞） （ALPL、RUNX2 CLEC11A）;B 细胞 （CD79A、MS4A1、IGHM、CD19）;NKT 细胞 （NKG7， GZMK， GZMA， GZMB， CD3D， CD3E， CD3G， TRAC）;内皮细胞（VWF、C AV 1、CLDN5、EGFL7、PECAM1）（图 1C）。在本研究中检测到的所有细胞中，T 细胞和髓样细胞最丰富，其次是 CAF 和 OB（成骨细胞）细胞（图 D）。OB 细胞主要分布在 MLN 和 PT 中，而 T 细胞和 NKT 细胞主要分布在 LN 中（图 1E）。

2.骨肉瘤进展过程中成骨细胞的转录特征

为了鉴定恶性细胞的克隆结构和细胞来源，使用 inferCNV 算法分析了 MLN、LN 和 PT 样本中 OB 细胞的 CNV 和克隆性。我们选择 PC 样本中的 OB 细胞作为参考，因为 PC 成骨细胞被认为是良性的。结果显示，PT 和 MLN 样本中的 OB 细胞在除 10 、 13 和 21 号染色体外的大多数染色体上表现出基因拷贝数增加，表明 PT 和 MLN 中的 OB 细胞是恶性骨肉瘤细胞 （OS 细胞）。相比之下，LN 中的 OB 细胞具有与参考细胞相似的拷贝数，表明它们是良性的（图 2A）。因此，PT 和 MLN 中的 OB 细胞被鉴定为恶性肿瘤细胞，即骨肉瘤细胞 （OS 细胞）。随后，我们检测了 PC、PT 和 MLN 中成骨细胞标志物的表达丰度。结果显示 ALPL 、 RUNX2 和 CLEC11A 在 PC 中低表达，而在 PT 和 MLN 中高表达 （均 p< 0.05，Wilcoxon 检验），这表明肿瘤进展过程中 OB 细胞异常激活和恶性转化 （图 2B）。我们还对患者 7 进行了拟时间分析，同时收集了 PC 、 PT 和 MLN。可以看出，患者 7 的结果与混合样本的结果相似。这表明，在 LN 转移过程中，OB 细胞可能遵循从 PC →PT → MLN（状态 3）或 PC→PT（状态 2）的分化路径（图 2）。2C，附加文件 5：图 S1）。许多基因在状态转换过程中表现出差异表达，表明这些基因可能介导 OS 的发病机制和 LN 转移 （图 2D）。此外，还介绍了各种组织中排名前 5 位的差异表达基因。这些基因可能参与 OS 的发病机制和转移，需要进一步研究 （图 2E）。

3.ETS2 通过 IBSP 介导 LN 转移

为了进一步探索转移的机制，我们将 OB 细胞细分为 7 个不同的亚组（图3A）。来自不同来源的样品中的 OB 细胞，并发现它们之间存在显著的异质性（图 D）。为了阐明 OB 细胞不同亚群的功能，我们对每个亚群的差异表达基因进行了 GSVA 分析。结果显示，C6 簇中的差异表达基因在 DNA_REPAIR、 NOTCH_ SIGNALING_PATHWAY、 WNT_SIGNALING_PATHWAY 和 PI3K_AKT_MTOR_SIGNALING 等与转移相关的通路中显著富集。C6 簇的 lls 被认为是最有可能执行迁移和侵袭功能的亚群（图 3C）。为了进一步确认 C6 亚组与 OS 转移的关联，我们编译了先前报道与 OS 转移相关的基因，并使用 AddModuleScore 使用这些基因对每个亚组进行评分。结果显示 C6 亚组得分最高，表明 C6 亚组与转移 （Fig. 3D） 关系最密切。使用 AUCell 时，类似的结果也适用（附加文件 6：图 S2C）。为了鉴定 C6 簇中的枢纽基因，我们交叉了以下三个基因集：与 PT 的 C6 相比，在 MLN 的 C6 中高度表达的基因 （MLN_C6 vs PT_C6），与 MLN 中的其他亚组相比，在 C6 中高度表达的基因 （C6 vs other_clusters），以及与 PC 的 OB 相比，在 PT 的 OB 中高度表达的基因 （PT vs PC）。获得了 16 个枢纽基因（图3E）。在 TARGET 数据库中对这些候选基因进行分析，发现只有两个基因（IBSP 和 CD24）具有显着的预后价值（图 D）。IBSP 基因编码骨唾液蛋白，该蛋白参与细胞粘附和迁移，可能与肿瘤转移有关。因此，IBSP 被认为是参与转移的 C6 亚组中的关键基因。在查阅 PROMO 数据库后，发现 ETS2 可能是调节 IBSP 的转录因子，相关性分析表明，ETS2 对 IBSP 具有调节作用，因此，我们认为 ETS2 是调节 IBSP 的潜在转录因子。

4. 验证 ETS2 通过 IBSP 在体外和体内促进骨肉瘤细胞转移

为了研究 IBSP 对肿瘤进展的影响，首先使用 RT-qPCR 检测比较了骨肉瘤细胞系 （143B， Saos2） 和正常成骨细胞 （hFOB1.19） 之间 IBSP 的表达水平，发现与 hFOB1.19 相比，IBSP 在 Saos2 和 143B 中的表达更高（图 1）。随后，我们在骨肉瘤细胞系中进行了 IBSP 和 ETS2 的沉默和过表达功能实验。在第一步中，我们设计了靶向 IBSP 的 siRNAs 过表达慢病毒载体，并在 Saos2 和 143B 细胞中进行了初步转染。结果表明，si-IBSP 01 表现出最佳的敲低效率（图 D）。4B 和 C），过表达慢病毒载体具有显著的过表达效率（图 4D 和 E）。因此，si-IBSP 01 和 IBSP 的过表达慢病毒载体被用于进一步的实验。Transwell 迁移和侵袭试验显示，IBSP 敲低显著降低了 Saos2 和 143Bcells 的迁移和侵袭能力（图 D）。4F 和 G）。相反，过表达 IBSP 显著增加了这两个细胞的迁移和侵袭能力（图 D）。4H 和 I）。随后，我们进行了免疫组织化学染色，证实了 IBSP 在骨肉瘤组织中的表达（图 D）。KaplanMeier 曲线显示，IBSP 的高表达与患者的不良预后相关 （p < 0.05） （图 4K），进一步支持 IBSP 参与肿瘤发生和进展。此外，与对照组相比，EdU 染色显示 siRNA 细胞中的细胞增殖和 EdU 掺入显著降低。

5. MLN 的空间转录组学特征

对 2 个转移性淋巴结样本进行空间转录组学分析。经过质量控制、降维和聚类，将患者 09 的斑点分为 5 个亚组。反卷积算法确定亚组 0 和 1 是 T 细胞，亚组 4 是 CAFs，亚组 4 是髓系细胞（附加文件 9：图 S5A 和 B）。亚组 2 与 AddModuleScore 算法一起被鉴定为 OB 细胞（附加文件 9：图 S5C）。在空间分布方面，OB 细胞位于 CAFs 和髓系细胞附近，这进一步证实了 OB 细胞与这两种细胞类型之间的相互作用。有趣的是，CAFs 充当屏障，分离 T 细胞，从而抑制 T 细胞对 OB 细胞的细胞毒作用（图 9A）。此外，IBSP 在 OB 细胞中高表达，这再次证实了 IBSP 高表达可能导致 LN 转移的观点（图 9B 和 C）。对于患者 11，斑点分为 5 个亚组。亚组 0 和 2 被鉴定为 OB 细胞，亚组 1 为 CAF，亚组 3 为内皮细胞（附加文件 9：图 S5D-F）。尽管患者 11 的 MLN 中没有 T 细胞和髓样细胞，但仍在 OB 附近观察到 CAFs，进一步证实了 CAFs 对 OB 的交互影响。此外，内皮细胞散布在 CAFs 和 OB 内，为肿瘤生长提供营养支持（图 9D）。