基本信息
题目：The role of Hfq in regulation of lipA expression in Pseudomonas protegens Pf-5
期刊：Scientific Reports
影响因子：4.259
影响因子：4.259
合作技术：EMSA
研究背景
脂肪酶是一种重要的工业酶，它存在于多种动物、植物和微生物中。商业脂肪酶主要来源于微生物。目前，脂肪酶被用于食品、饮料、石油、洗涤剂、化妆品、纸张、污染控制和生物能源工业。然而，传统发酵条件的优化也不能克服细菌脂肪酶的生产过程中的问题。因此为了解决这些问题，有必要阐明其对脂肪酶的基因表达调控的分子机制。
研究背景
脂肪酶是一种重要的工业酶，它存在于多种动物、植物和微生物中。商业脂肪酶主要来源于微生物。目前，脂肪酶被用于食品、饮料、石油、洗涤剂、化妆品、纸张、污染控制和生物能源工业。然而，传统发酵条件的优化也不能克服细菌脂肪酶的生产过程中的问题。因此为了解决这些问题，有必要阐明其对脂肪酶的基因表达调控的分子机制。
假单胞菌脂肪酶是一种被研究的较清楚的脂肪酶。然而很少有针对脂肪酶表达调控的机制进行研究。Hfq是一种广泛调控蛋白，能够影响细菌生存的各种生理过程，控制多种基因的表达，调节细菌的蠕动，参与细菌群感应系统的管理。在本研究中，通过敲除或过表达hfq和rsmY基因，研究Hfq对脂肪酶表达的调控。研究发现，Hfq在转录水平和翻译水平调节脂肪酶的表达，主要表现在转录水平的调控。同时Hfq还调控rsmY的表达及维持rsmY的稳定性。将Hfq / rsmY双基因敲除，发现hfq可以直接结合rsmY来调控脂肪酶的激活。总之，这项研究表明在假单胞菌pf - 5中，Hfq通过在转录水平上调控rsmY的表达来影响脂肪酶的表达。
研究内容及结果
为了研究Hfq和lipA之间的关系，本文先通过同源重组的方法敲除及突变hfq基因，得到四个基因的突变株。并通过PCR的方法检测基因敲降成功。将hfq突变后检测了Pf-5的生长、脂肪酶的表达及活性，同时检测了β-半乳糖苷酶的活性。实验结果显示hfq被突变后，单胞菌Pf-5生长水平受到抑制，脂肪酶转录水平表达受到抑制，同时脂肪酶活性显著降低，β-半乳糖苷酶的活性也显著降低。
在野生型假单胞菌pf- 5中，通过同源重组的方法过表达hfq，恢复了hfq突变体中脂肪酶的相对活性，结果表明hfq基因敲除在启动子水平上影响脂肪酶表达以及活性。此外，在hfq突变型中过表达hfq后检测脂肪酶和β-半乳糖苷酶的活性，结果显示与野生型相比，这两种酶的活性都恢复了。这些结果说明hfq在转录水平和翻译水平参与lipA的表达以及脂肪酶表达的调控。
将phrs、rsmA，rsmE、remY、rsmZ的启动子构建到lacZ报告基因的启动子区域，转染进hfq敲降后的假单胞菌，检测β-半乳糖苷酶活性。结果显示，转染phrs、rsmA，rsmE重组质粒后β-半乳糖苷酶的活性没有变化，rsmZ的活性发生了轻微的变化，而rsmY的活性变化很明显。这些结果表明hfq可能通过remY或rsmZ影响lipA的表达。
使用纯化后的hfq蛋白，通过EMSA实验进一步研究hfq与rsmY是否结合。EMSA实验结果显示hfq不能与rsmA、rsmE、rsmZ的启动子序列结合，但是可以与rsmY结合。竞争性EMSA实验结果显示，随着非标记rsmY探针浓度增加，与hfq蛋白结合的标记探针越来越少，这个结果说明hfq蛋白可以与rsmY结合。
据报道，Hfq和rsmY的结合可以维持rsmY的稳定。然而，在pf - 5中，Hfq没有被研究过。因此本文先研究了利福平处理后，pf-5野生型和hfq突变株中rsmY的稳定性变化。结果表明，与野生型相比，hfq突变体中rsmY的稳定性明显降低。这个结果显示Hfq通过调节rsmY的稳定性来影响表达rsmY，进而影响脂肪酶的表达。
通过PCR确定rsmY基因被敲除后(图6A)，对脂肪酶表达进行了测定，验证了rsmY在调节脂肪酶表达中的作用。实验结果hfq被敲除的细胞中脂肪酶表达量减少。hfq和rsmY 都被敲除的细胞内，脂肪酶表达量显著下调(图6B和C)。此外，在hfq突变体中，将rsmY恢复表达，结果显示脂肪酶的表达水平与野生型表达水平相似。在野生型和hfq突变型菌株中，过表达rsmY后lipA的表达水平都显著上调。
文章小结
1. Hfq基因被敲降后，pf-5菌株中脂肪酶的表达量显著下调，同时细菌生长受到抑制，说明hfq调控lipA的表达和脂肪酶的活性。
2. hfq可能通过remY或rsmZ影响lipA的表达。
3. EMSA实验表明hfq蛋白可以与rsmY结合。
4. Hfq通过调节rsmY的稳定性来影响表达rsmY，进而影响脂肪酶的表达。
5. Hfq通过在转录水平上调控rsmY的表达来影响脂肪酶的表达。
解析文献
Wu Liu, Menggang Li, et al. The role of Hfq in regulation of lipA expression in Pseudomonas protegens Pf-5. Scientific. Reports. 7 (1) :10356(2017).
Wu Liu, Menggang Li, et al. The role of Hfq in regulation of lipA expression in Pseudomonas protegens Pf-5. Scientific. Reports. 7 (1) :10356(2017).
参考文献
1. Houde, A., Kademi, A. & Leblanc, D. Lipases and their industrial applications: an overview. Appl. Biochem. Biotechnol. 118, 155–70(2004).
2. Soberon-Chavez, G. & Palmeros, B. Pseudomonas lipases: molecular genetics and potential industrial applications. Crit. Rev. Microbiol. 20, 95–105 (1994).
3. Krzeslak, J., Gerritse, G., van Merkerk, R., Cool, R. H. & Quax, W. J. Lipase expression in Pseudomonas alcaligenes is under the control of a two-component regulatory system. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1402–11 (2008).
4. Rosenau, F. & Jaeger, K. Bacterial lipases from Pseudomonas: regulation of gene expression and mechanisms of secretion. Biochimie82, 1023–32 (2000).