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切向流过滤:血红蛋白纯化

作者:瑞普利金(上海)生物科技有限公司 2013-07-17T00:00 (访问量:4338)

切向流过滤:血红蛋白纯化

 

在现代医学中,输血是出血性休克、贫血等病症重要的治疗方法,也是常规手术的重要组成部分,但是肝炎及AIDS等小概率传播风险,总是干扰着输血的安全进行。此外,输血前,还需对供体血液进行分型,并与受体血型交叉匹配,以避免出现排异现象。对此,一种相对简便的替代方法是,使用血红蛋白(Hb)类氧载体(HBOCs)取代供体红细胞(RBCs),其具有以下优点:首先,由于HBOCs表面没有血型抗原,一般不会引起排异现象;其次,在Hb纯化过程中灭活并清除了病毒,所以大大降低了血源性疾病传播的可能性。

Hb通常从人或牛RBCshRBCsbRBCs)中提取。对纯化的Hb进行化学修饰是HBOCs合成的一种主要途径,化学修饰型HBOCs可以通过分子内交联Hb、聚合Hb或将聚合物结合到Hb表面的方法来完成。Hb也可以包埋到固体或中空颗粒内部,以形成非化学修饰型HBOCs

从裂解的RBCs中提取并纯化Hb前,需先去除血液中的白细胞、血小板及血浆成分,可先离心并漂洗血液,以分离血浆和白细胞层。所得的RBCs再用低渗溶液孵育裂解。

RBC裂解液中纯化Hb的方法有很多种,包括有机溶液萃取以及离子交换色谱分离。色谱方法又可以大体归类为吸附方法(Hb被截留在固相介质内,然后溶剂洗脱)或直流方法(杂质被截留,而Hb被洗脱)。直流方法消除了吸附和洗脱过程,但与吸附方法相比,所得的Hb纯度较低。但两者都受到血细胞裂解方法及裂解状态的影响。

在还原剂存在的绝氧条件下进行加热,也可以进行Hb的纯化。在该过程中热敏感性蛋白选择性沉淀,而病毒被灭活,但Hb也有可能因为高温而失活,所以需要添加稳定剂,以防止Hb变性。

微滤和超滤也是Hb纯化的常用技术,可有效降低Hb溶液中的病毒载量。但是常规的过滤技术通常需要配合化学修饰和分馏操作,以从未修饰型Hb和其它杂质中分离修饰型Hb,且由于细胞碎片堵塞膜孔,造成流速降低。针对这些问题,本文将介绍一种多阶段式过滤方法。在该方法中,大多数细胞碎片在第一阶段(膜MWCO 50nm)被清除,然后连续过滤,逐步清除较大的细胞碎片和分子。该技术相对简单,且可同时进行Hb的纯化和浓缩。

 

材料 & 方法

RBCs溶液起始处理量为1,000 mL,离心后,用等渗盐水漂洗去除非细胞性Hb和血浆蛋白,再用PB溶液冰浴裂解RBCs,裂解液终体积为2,000 mL

仪器使用KrosFlo 研发用IIi 切向流过滤系统(SYR2-U20-01N)和4根中空纤维过滤组件,组件MWCO规格分别为50nmM10S-360-01P)、500kDM1-500S-260-01N)、100kDM1AB-360-01P)和50kDM15S-360-01P)。系统设置如图1。组件使用前用去离子水完全浸湿,并进行完整性测试。

在每个过滤阶段,收集滤液,并循环回流液,以提高Hb产量。但在阶段III1LPB溶液进行洗滤操作。整个纯化工艺在生物安全柜内进行,滤液及回流液容器置于冰上。每个阶段开始和结束时测量滤液流速和跨膜压,并在各阶段处理结束后,从滤液中取出10mL,做进一步分析。阶段I起始过滤量为2,000 mL RBCs裂解液。每次运行结束后,HF组件、相关软管和容器均用0.5M NaOH溶液清洗,以清除可能粘附到HF膜上的蛋白,并降解可能存在的内毒素。