Molecular Devices ClonePix结合CloneSelect Imager技术加强开发病毒特异性的杂交瘤细胞-分析方法-资讯-生物在线

Molecular Devices ClonePix结合CloneSelect Imager技术加强开发病毒特异性的杂交瘤细胞

作者:美谷分子仪器(上海)有限公司 2014-03-26T00:00 (访问量:5011)

 

 

 

ClonePix结合CloneSelect Imager技术加强开发

 

 

病毒特异性的杂交瘤细胞

        双链DNA病毒引起人类大多数疾病。疱疹病毒和腺病毒家族和乳头瘤病毒在人体中会产生相似的症状。而且,由于病毒抗原基因组的保守,对于特殊病毒的血清学和蛋白诊断确认是非常复杂的。高度的蛋白同源性和血清交叉反应导致双链DNA病毒物种之间区分是非常困难的。本研究的目的是发现识别最优的分泌高度特异性、无交叉反应的单克隆抗体的细胞系,用于生物治疗的开发。

        ClonePix系统用来高通量从母本的杂交瘤细胞中(历史数据表明母本的细胞系产量少于1mg/L的单抗)筛选数以百计的亚克隆。分泌高IgG的活细胞进一步用客观评价细胞生长的CloneSelect Imager系统来评估。高效自动化克隆选择技术旨在挽回高滴度的杂交瘤细胞系,这些细胞系能生产抗原高特异性的抗体。ClonePixCloneSelect Imager配套技术为免疫诊断技术发展提供了足够的病毒抗原的特异性抗体。

 

材料

l         ClonePix System (Molecular Devices, LLC)

l         CloneSelect Imager (Molecular Devices, LLC)

l         CloneMedia Semi-Solid Media for hybridomas/myelomas (Molecular Devices, LLC Cat #K8600/K8610)

l         CloneDetect Reagent, Mouse IgG (H+L) Specific,Fluorescein (Molecular Devices, LLC Cat #K8220)

 

 

挽救低产量的杂交瘤细胞

        传统杂交瘤开发的方法涉及骨髓瘤细胞和抗原免疫过的宿主脾细胞的化学介导融合过程。融合的杂交瘤细胞经历了众所周知漫长和低效率的有限稀释法的选择过程,接着用ELISA方法筛选分离出有限数目的抗原特异性单克隆杂交瘤细胞。太长的时间战线(超过30周)和大量的处理过程,使有限稀释法产生不能准确量化活性和生产力的低滴度细胞系。

        最早的双链DNA 病毒特异性杂交瘤细胞系是1990s用有限稀释方法开发的,但是筛选的杂交瘤细胞单克隆性和稳定性都不是很好。用不同的血清和培养基组分进行多年的重复培养(静态的和旋转的),这些克隆表现出不稳定(图1)。而且,抗体的产率从来没有超过3mg/L。由于在preps中能观察的差别巨大的聚集物,使得纯化的IgG的质量很难保持一致性。

 

 

 

通过亚克隆高滴度抗体的亲本细胞系,挽回和稳定特异性的杂交瘤细胞系。ClonePix技术平台利用半固体培养基和CloneDetect无标记检测技术重筛了大量以前融合的杂交瘤细胞(图2),显示了明显的技术优势。

ClonePix高通量筛选方法能够从低产的亲本克隆细胞中挽回高产、稳定的细胞。

                     

 

筛选和识别中试规模分析的亚克隆

 

用合成的具有抗体表位的多肽,对筛选到的前146生长速率的克隆进行抗原特异性分析。多肽和抗体显示了很强的的亲和性,完全符合前期研究的阐释,因此,合成的多肽用来筛选新的,具有高抗体亲和性的亚克隆。 

生物素标记的多肽加载在含链霉素的微孔板表面,再加146个没有稀释的杂交瘤细胞上清液,测定IgG的结合能力。从中选取了前7个显示了最优结合力的特殊亚克隆。

 

 

IgG分泌亚克隆的中试规模生产

7个高价值特异的亚克隆在液体培养基规模化生产。这些克隆被扩增,一旦获得足够的培养基体积,5个亚克隆被冷冻用于将来的研究参考。而剩下的2个高亲和/IgG分泌克隆继续扩增2-3周,直到完成中试生产(1升)。

挽救低产量杂交瘤细胞的工作流程

为了识别用于发展高级诊断的双链DNA病毒特异抗体的亚克隆,ClonePix技术筛选480FITC阳性的杂交瘤克隆,基于半固体培养基技术和FITC标记的CloneDetect试剂。CloneSelect Imager 识别了其中146个快速生产的克隆,7个高产量的克隆被确认和目标多肽具有高度的特异性。选择其中的2个亚克隆进行中试生产和剩余的5个作为细胞银行。这个流程降低了杂交瘤细胞的筛选时间,最多为常规有限稀释法筛选时间的50%,而且筛选了强健的目标克隆细胞作为其他附加的研究和生产。

单克隆的验证和IgG分泌子的均一化

ClonePix系统再克隆和特异性确认之后,2个亚克隆扩增,重新种到具有CloneDetect试剂的半固体培养基的6孔板中。ClonePix系统成像和分析表明克隆正常的分泌了IgG,同时,通过均相均一化过程,能观察到高产IgG的克隆(图5)。

 

                        

                       

 

新双链DNA病毒杂交瘤细胞亚克隆的生产能力

利用ClonePix技术重新筛选低产量的亲本克隆。高产、稳定的亚克隆被挽回。Protein G纯化单克隆抗体,定量总产量。相比亲本克隆的历史产量(~1mg/L),新的亚克隆细胞IgG的产量明显地增加(17-25mg/L),图6显示。   

 

 

结论

ClonePix技术改善了筛选时间周期和亚克隆杂交瘤细胞的质量,降低手动操作。而且,CloneMatrix MediaCloneDetect 试剂提高了分泌克隆的生长和检测灵敏度。ClonePix的数据表明亲本的低生产力源于小数目生产抗体的细胞被快速、无生产抗体能力的细胞压制。

相比亲本杂交瘤细胞的产量(05-1mg/L), 结合CloneSelect Imager的使用,ClonePix 系统被证明是能识别高产(17-25mg/L)、高亲和力杂交瘤细胞亚克隆的强有力工具。因此,该技术有助于推进双链DNA病毒特异性的新治疗性抗体的发展。

 

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