ClonePix结合CloneSelect Imager技术加强开发
病毒特异性的杂交瘤细胞
双链DNA病毒引起人类大多数疾病。疱疹病毒和腺病毒家族和乳头瘤病毒在人体中会产生相似的症状。而且,由于病毒抗原基因组的保守,对于特殊病毒的血清学和蛋白诊断确认是非常复杂的。高度的蛋白同源性和血清交叉反应导致双链DNA病毒物种之间区分是非常困难的。本研究的目的是发现识别最优的分泌高度特异性、无交叉反应的单克隆抗体的细胞系,用于生物治疗的开发。
ClonePix系统用来高通量从母本的杂交瘤细胞中(历史数据表明母本的细胞系产量少于1mg/L的单抗)筛选数以百计的亚克隆。分泌高IgG的活细胞进一步用客观评价细胞生长的CloneSelect Imager系统来评估。高效自动化克隆选择技术旨在挽回高滴度的杂交瘤细胞系,这些细胞系能生产抗原高特异性的抗体。ClonePix和CloneSelect Imager配套技术为免疫诊断技术发展提供了足够的病毒抗原的特异性抗体。
材料
l ClonePix System (Molecular Devices, LLC)
l CloneSelect Imager (Molecular Devices, LLC)
l CloneMedia Semi-Solid Media for hybridomas/myelomas (Molecular Devices, LLC Cat #K8600/K8610)
l CloneDetect Reagent, Mouse IgG (H+L) Specific,Fluorescein (Molecular Devices, LLC Cat #K8220)
挽救低产量的杂交瘤细胞
最早的双链DNA 病毒特异性杂交瘤细胞系是1990s用有限稀释方法开发的,但是筛选的杂交瘤细胞单克隆性和稳定性都不是很好。用不同的血清和培养基组分进行多年的重复培养(静态的和旋转的),这些克隆表现出不稳定(图1)。而且,抗体的产率从来没有超过3mg/L。由于在preps中能观察的差别巨大的聚集物,使得纯化的IgG的质量很难保持一致性。
通过亚克隆高滴度抗体的亲本细胞系,挽回和稳定特异性的杂交瘤细胞系。ClonePix技术平台利用半固体培养基和CloneDetect无标记检测技术重筛了大量以前融合的杂交瘤细胞(图2),显示了明显的技术优势。
ClonePix高通量筛选方法能够从低产的亲本克隆细胞中挽回高产、稳定的细胞。
筛选和识别中试规模分析的亚克隆
用合成的具有抗体表位的多肽,对筛选到的前146生长速率的克隆进行抗原特异性分析。多肽和抗体显示了很强的的亲和性,完全符合前期研究的阐释,因此,合成的多肽用来筛选新的,具有高抗体亲和性的亚克隆。
生物素标记的多肽加载在含链霉素的微孔板表面,再加146个没有稀释的杂交瘤细胞上清液,测定IgG的结合能力。从中选取了前7个显示了最优结合力的特殊亚克隆。
高IgG分泌亚克隆的中试规模生产
7个高价值特异的亚克隆在液体培养基规模化生产。这些克隆被扩增,一旦获得足够的培养基体积,5个亚克隆被冷冻用于将来的研究参考。而剩下的2个高亲和/高IgG分泌克隆继续扩增2-3周,直到完成中试生产(1升)。
挽救低产量杂交瘤细胞的工作流程
为了识别用于发展高级诊断的双链DNA病毒特异抗体的亚克隆,ClonePix技术筛选480FITC阳性的杂交瘤克隆,基于半固体培养基技术和FITC标记的CloneDetect试剂。CloneSelect Imager 识别了其中146个快速生产的克隆,7个高产量的克隆被确认和目标多肽具有高度的特异性。选择其中的2个亚克隆进行中试生产和剩余的5个作为细胞银行。这个流程降低了杂交瘤细胞的筛选时间,最多为常规有限稀释法筛选时间的50%,而且筛选了强健的目标克隆细胞作为其他附加的研究和生产。
单克隆的验证和IgG分泌子的均一化
ClonePix系统再克隆和特异性确认之后,2个亚克隆扩增,重新种到具有CloneDetect试剂的半固体培养基的6孔板中。ClonePix系统成像和分析表明克隆正常的分泌了IgG,同时,通过均相均一化过程,能观察到高产IgG的克隆(图5)。
新双链DNA病毒杂交瘤细胞亚克隆的生产能力
利用ClonePix技术重新筛选低产量的亲本克隆。高产、稳定的亚克隆被挽回。Protein G纯化单克隆抗体,定量总产量。相比亲本克隆的历史产量(~1mg/L),新的亚克隆细胞IgG的产量明显地增加(17-25mg/L),图6显示。
结论
ClonePix技术改善了筛选时间周期和亚克隆杂交瘤细胞的质量,降低手动操作。而且,CloneMatrix Media和CloneDetect 试剂提高了分泌克隆的生长和检测灵敏度。ClonePix的数据表明亲本的低生产力源于小数目生产抗体的细胞被快速、无生产抗体能力的细胞压制。
相比亲本杂交瘤细胞的产量(05-1mg/L), 结合CloneSelect Imager的使用,ClonePix 系统被证明是能识别高产(17-25mg/L)、高亲和力杂交瘤细胞亚克隆的强有力工具。因此,该技术有助于推进双链DNA病毒特异性的新治疗性抗体的发展。
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