在自身免疫性疾病、慢性感染、移植排斥和癌症中遭受慢性炎症和抗原持久性的组织中发现了三级淋巴结构 (TLS)。肿瘤内 TLS 的存在和密度与许多癌症类型的良好预后相关。

TLS 是在成纤维细胞网络上形成的有组织的淋巴样聚集体，包括一个 T 细胞区，其中成熟的树突细胞与 T 细胞接触，以及一个滤泡性 B 细胞区。在本篇文章中，解决了 TLS 作为 B 细胞原位成熟驱动因素、产生抗体 PC 的作用以及它们对 ICI 反应的问题。研究了肿瘤的空间转录组结构原发性透明细胞肾细胞癌 (ccRCC) 的微环境 (TME)。

新鲜样本空转转录组、石蜡样本空间转录组、免疫组化技术、多重免疫荧光。

1. 空间转录组揭示了TLS+ 肿瘤中富含 B 细胞的热点区域

作者利用10X Genomics Visium 空间转录组学技术对 24 个 ccRCC 原发性肿瘤（冷冻切片（n = 12）和 FFPE 切片（n = 12））进行空间转录组学测试。结果发现，Ca9是ccRCC肿瘤细胞的标志物，在大多数ccRCC肿瘤中的表达与23/24肿瘤中的表达一致，并且在肿瘤切片中分布均匀。使用微环境populations (MCP)-counter评估 TME 的免疫和基质细胞群的分布，该counter从转录组谱估计细胞类型丰度。在下图所示的  TLS+ 肿瘤中，B 细胞和 T 细胞在TLS 区域中表达 。这些CD8 T细胞在肿瘤中低表达，在 TLS 区域略有富集。TLS 中的单核细胞分布较多，而 NK 细胞更广泛地分布在整个肿瘤切片中。内皮细胞和中性粒细胞均匀分布，在 TLS 内分布较少。但成纤维细胞在 TLS 区域内分布较多。这些不同的 TME 空间组织模式在 8 个 TLS+ 和 4 个 TLS-  冷冻切片肿瘤以及 10 个 TLS+ 和 2 个 TLS- FFPE 肿瘤中始终可以识别，这表明 TLS 与 B 细胞、T 细胞和成纤维细胞特征的表达有关。

2. Ig 和 B 细胞相关基因在 TLS中的显著富集促使研究关注 B 细胞

通过对肿瘤区域和TLS区域的差异分析显示，免疫细胞的基因表达和成纤维细胞基因表达组成了TLS区域的主要表达特征，Ig 和 B 细胞相关基因在 TLS 中的显著富集促使研究关注 B 细胞。PC 相关基因 MZB1 的表达在 TLS 中高，而在冷冻切片肿瘤的肿瘤区域中总体低。由于 PC 的主要功能是产生抗体，于是分析了免疫球蛋白基因的空间表达。最终证实了成纤维细胞与 CXCL12、MZB1 与成纤维细胞以及 MZB1与 CXCL12 在距 TLS 一定距离处的共定位。总结来说，在 TLS+ 肿瘤中，表达IGHG1 和 IGHA1的 PC 存在于 TLS 附近，并且可能随成纤维细胞一起在肿瘤内迁移。

3. 空间B细胞受体（BCR）分析可识别原位超突变和克隆选择

TLS 中 B 细胞成熟亚型和 PC 的共定位暗示了原位 B 细胞适应性免疫的产生。在此过程中，B 细胞会突变其 B细胞受体 (BCR) 序列，并选择和扩增最亲和的克隆。所以作者研究了 BCR 的核苷酸序列。因为Visium冰冻切片空间技术原理是基于芯片中不同spot点位上Bracode的RNA测序，这使得作者能够查询原始转录物并进行空间BCR分析。作者结合bulk RNA-seq数据发现TLS具有大量单一的轻链克隆型，突变的V基因转录本数量较少，多数突变序列转录本位于TLS远端肿瘤区域。

4. TLS的浆细胞沿着成纤维细胞轨迹扩散

为了分析肿瘤内 PCs 和成纤维细胞的位置以及原位 CXCL12 的表达，作者利用多重免疫标记（IF），在远离 TLS 的地方发现PC 沿着成纤维细胞轨道排列，嵌入在密集的 COL1+ CXCL12+ 成纤维细胞网络中，从而证明它们在肿瘤床中的迁移。数据分析了 Ig 和成纤维细胞转录物的共表达，以及成纤维细胞转录物和 CXCL12 的共表达，并验证了PC 在 TLS 内的位置以及空间转录组学确定的成纤维细胞网状细胞 (FRC) 在空间上的位置。值得注意的是，在被 MUM1+ IgG+成纤维细胞轨道包围的肿瘤巢中检测到与肿瘤细胞结合的 IgG。

5. TLS and Ig-producing PCs 与结合到凋亡肿瘤细胞的 IgG 抗体和对免疫治疗的反应相关

为了进一步研究 TLS、肿瘤内PC和Ig染色之间的联系，首先分析了TLS成熟度。作者研究了 103 个肿瘤中 TLS 的存在与 PC 密度之间的相关性。发现含有 CD23+ FDC 网络、BCL6+ 细胞和 PNAd+ HEV 的 TLS 与  MUM1+IgG+ PC 和 MUM1+IgA+ PC 密度之间存在很强的相关性。后面又进一步研究了 57 个 TLS+ 样本上 TLS 成熟度标记与 MUM1+IgG+ 和  MUM1+IgA+ PCs 密度的相关性。

作者为了揭示肿瘤结合IgG抗体的功能，分析肿瘤细胞凋亡特征，结果显示在IgG+肿瘤细胞＞60%的样本中， Caspase 3活化的肿瘤细胞密度显著升高。CD68+巨噬细胞与IgG+/cleaved caspase 3+肿瘤细胞距离更近。

肿瘤的三级淋巴结构（TLS）会影响癌症免疫治疗的效果。文章采用10x Genomics Visium空间转录组测序方法对冰冻切片和FFPE切片进行测序，鉴定肾细胞癌三级淋巴结构特征，以及浆细胞传播途径与肿瘤细胞Caspase3活化和免疫抑制剂治疗应答的关系，揭示了前人未发现的在癌组织中B细胞对治疗和预后的显著意义，为未来肾细胞癌治疗提供了思路。