肿瘤学研究之——评价细胞迁移的高通量成像检测法

    在研究诸如转移性肿瘤、炎症和慢性疾病中，观察细胞的迁移是一个很重要的方法。检测细胞迁移的方法有助于更清楚的了解疾病的机制，对于药物和治疗效果的评判也是极其重要的。我们介绍一种新的方法，即结合MD ImageXpress Micro高内涵系统和Oris 细胞迁移检测板，用以检测细胞的迁移。

    Oris细胞迁移检测板是一个96孔板形式的耗材，硅胶块能够封闭住的中心区域，使中间区域无法铺种细胞。当硅胶块移除后，周围细胞迁移进入中心区域，此时可以使用活细胞试剂，如Calcein-AM进行荧光标记，或将细胞固定后标记细胞核进行检测分析。

    使用ImageXpress Micro高内涵系统能够进行整孔成像，因此能够高速高效的获取孔内迁移区域的图像。

介绍

    Oris 细胞迁移板使用硅胶块封闭96孔板每个孔的中心区域，使中心区域无法铺种细胞，从而在孔中心获得一个直径2mm的环形检测区域，当细胞发生迁移，周围的细胞会迁移进入中心监测区域。Oris细胞迁移板提供多种细胞外基质，如I型胶原和纤维粘连蛋白，铺涂于96孔板，用于细胞迁移实验。我们采用了HT-1080和MDA-MB-231细胞在铺有三种不用细胞外基质的Oris板上研究不同水平MEK抑制剂U0126对细胞迁移的作用。该实验中，我们可以看到ImageXpress Micro高内涵系统能够快速方便的获得每个孔内包含监测区域的图像。软件系统能够自动计算孔中心监测区域迁移细胞所占据的面积，从而快速获得实验结果。

材料

●Oris细胞迁移检测板

●HT-1080纤维肉瘤细胞

●MDA-MB-231乳腺癌细胞

●HT-1080细胞培养液：含有10%高温灭火FBS的EMEM，抗生素，碳酸氢钠，丙酮酸钠。

●PBS

●8%戊二醛

●Triton X-100

●DMSO

●MEK抑制剂U0126

●PI

●ImageXpress Micro高内涵系统

实验方法

1. 将HT-1080和MDA-MB-231细胞以30000细胞/孔的密度种植于三种细胞外基质包被的Oris细胞迁移板中（图1）。在37度下培养6小时，使细胞牢固贴壁。

2. 6小时后，除对照孔外，移除Oris板上的封闭硅胶（1,5,9列）

3. 在37度下，孔内加入0.1% DMSO或MEK抑制剂U0126，孵育16小时，使细胞发生自由迁移。

4. 以0.25%戊二醛固定细胞，以0.1%Triton X-100破膜。

5. PBS冲洗，1ug/mL PI室温下孵育30分钟。无需二次冲洗。

6. 样品放入ImageXpress Micro高内涵系统，在2X物镜下和标准的Cy3滤色片组进行细胞成像。在2X镜下，ImageXpress Micro系统能够进行整孔成像，可以一次获得整个孔内细胞区域和检测区域的图像。

图1. 包被有三种不同基质的Oris细胞迁移板。A-D行种以HT-1080细胞，E-H行种以MDA-MB-231细胞。

结果

    ImageXpress Micro系统获得孔内图像，采用优化的分析系统辨认荧光细胞并在特定区域（ROI）辨认背景。通过对中心检测区域内细胞的识别，可以分析出迁移进入该区域的细胞的数量。 ImageXpress Micro系统在5分钟内自动获得全部图像，图像自动保存入MDCStor数据库内，当需要时，可以进行所有图像的自动分析。

图2. ImageXpress Micro系统2x镜头下获得的孔内图像。右图显示环状检测区域。

    实验结果显示，HT-1080和MDA-MB-231细胞在胶原包被的孔内的迁移数量要高于未包被或纤维粘连蛋白包被。可以看到，HT-1080细胞迁移占据了较MDA-MB-231细胞更多的中间ROI区域。

图3. 结果显示，两种细胞在胶原包被表面较未包被或纤维粘连蛋白包被表面迁移更加明显。

    MEK抑制剂U0126对不同表面包被孔内细胞都表现出了剂量依赖性抑制作用。但是在未包被和纤维粘连蛋白包被孔内的抑制作用更加复杂。

    同时，ImageXpress Micro在检测过程中能够将检测区域ROI外细胞排除而只检测ROI内迁移细胞，因此检测窗口大，检测灵敏度高。

图4. 图表显示，相对于对照组抑制剂的抑制百分比。U0126对于胶原表面包被孔内细胞的抑制作用弱于其他表面包被孔内的细胞。

总结：

●HT-1080和MDA-MB-231细胞对MEK抑制剂U0126表现出剂量依赖性的抑制作用。

●如结果显示，ImageXpress Micro高内涵系统适合于进行细胞迁移的研究，由于可以将ROI区域外细胞排除在外，因此检测窗口大，检测灵敏度高。

●Oris细胞迁移板使用方便，易于操作，可用于活细胞或固定细胞（活细胞数据未展示）