全自动高内涵成像分析系统应用
——肿瘤学研究：细胞周期及凋亡全自动分析
摘要
在肿瘤学研究及治疗过程中，监控细胞周期及凋亡的状态是一个非常重要的指标。 与传统的检测方法相比，如流式细胞FACS，全自动高内涵成像分析系统可对原位（无需消化悬浮处理）细胞进行全自动成像，并完成单个细胞水平的多参数分析。MetaXpressTM图像分析及获取软件具有一系列常用且操作简单的应用分析模块。AcuityXprssTM细胞生物学分析软件可对高内涵成像分析产生的海量数据进行可视化管理及数据挖掘。
MetaXpress软件中的细胞周期分析模块，就是专门为细胞周期及凋亡分析开发的应用模块[Fig 1]。该模块采用自适应背景扣除技术（Adaptive Background CorrectonTM, ABC），排除因样品制备等原因带来的背景不均匀的问题，准确的将细胞与背景区分开来。该模块可对简单的均质DNA染料（如DAPI/Hoechst/PI）染色后的细胞进行细胞周期状态分析[Fig 2-3]，也可用更准确的有丝分裂和/或凋亡标志物进行分析[Fig 1]。
Fig 1: 细胞周期分析模块界面
Fig 2. 根据每个细胞内DNA含量-总荧光强度，在2N和4N的双峰图中设定阈值，确定G0/G1，S，G2期。
Fig 3. 单色DNA染料标记下，可根据每个细胞内染色体的聚集度-平均荧光强度，设定处于分裂期细胞的阈值，确定处于分裂期的细胞，结合2N/4N参数，进一步确定分裂早期Early M及晚期 Late M。
下面的实例中，我们将用阳性化合物处理细胞后，分析其对细胞周期及凋亡状态的影响。我们将用MetaXpress软件中的细胞周期模块，展示一个集快速、简单、灵活性为一体的细胞周期及凋亡分析方法。
材料及方法
样品制备
- 前列腺癌Du145细胞以8,000/孔接种于96孔板中。
- 分别将紫杉醇Taxol和星形孢菌素Staurosporine以一定的浓度梯度处理细胞24小时。
- 将细胞固定，并分别用Hoechst33342（Invitrogen）、anti-phospho Histone H3ser10 （Upstate）（Texas Red 标记二抗） 和anti-cleaved PARP （Cell Signaling） （FITC标记二抗 ）染色。
图像获取
1． 使用ImageXpress Micro高内涵成像仪器，通过MetaXpress软件自带标准Protocol，对96孔板分别用10倍平场半复消色差物镜和20倍平场半复消色差物镜全自动获取图像。
2． 每孔获取4个视野图像。
运用细胞周期模块对获取的图像进行分析
1． 选择标记DNA的图像：Hoechst 标记细胞核，反映DNA含量及结构。
2． 设定细胞核的大小范围及与背景荧光强度对比值。
3． 设定分裂期细胞参数：通过染色标记的DNA强度界定或有丝分裂标志物（anti-phospho Histone H3ser10）界定。
4． 通过凋亡标记物（anti-cleaved PARP）设定处于凋亡状态的细胞。
5． 预览分析结果，互动方式调整分析参数。
6． 对所有图像进行自动化分析。
数据处理
1． 分析数据导入Excel软件中进行分析。
2． 运用高内涵生物信息学软件AcuityXpress对数据进行挖掘，包括曲线拟合、IC50/EC50计算及Hit selection等。
Fig 4. 运用细胞周期模块进行图像分析，根据DNA含量及结构对细胞所处的周期状态进行分析。分析结果图像与原始图片对比图： a) 20X 原始图片， b) 20X 分析图片， c) 10X原始图片， d) 10X分析图片。
Fig 5. 在10倍和20倍物镜获取或不同染色标记分析的情况下，药物处理之后的药效结果一致。DNA Avg. Intensity 或 DD 表示运用DNA平均荧光强度界定分裂期细胞。H3s10表示用特异性分裂期标志物 （anti-phospho Histone H3ser10）界定分裂期细胞。 A 表示凋亡Apoptosis， M 表示分裂mitosis。
结论
1． 细胞周期分析模块可进行准确的细胞核及细胞状态分析
2． 细胞周期分析模块参数设置简单、操作方面、可通过柱型图和散点图互动调节参数。
3． 用10倍和20倍物镜获得的最终数据，其分析结果一致。
4． 分别运用DNA荧光强度定义分裂期细胞与分裂期特异性标志物定义分裂期细胞，两种方法分析结果一致。