本期解读
题目：Decellularizationoptimizes the inhibitory microenvironment of the optic nerve tosupport neurite growth
期刊：Biomaterials
影响因子：10.317
合作技术：label-free定量蛋白质组学
研究背景
细胞外空间中神经元的多种元素组合构成了神经组织的微环境，在神经损伤修复中起关键作用。先前已有众多研究，尝试通过改变微环境中“促进剂”和“抑制剂”的平衡的方式，以增强损伤后的神经再生。因此，探索调控损伤后神经组织微环境中促进剂和抑制剂平衡的方法具有重要的科学意义。特殊的大脑神经视神经（ON）的视觉通路具有中枢神经微环境。
先前的研究显示，ON难以在体内和体外支持轴突再生，研究集中于不同脱细胞组织支架的结构和生物学效应。脱细胞处理的坐骨神经（DSN）、脊髓（DSC）和脑细胞已被用于修复不同的神经组织损伤。由于脱细胞技术是去除包括大多数免疫原和可溶性蛋白的细胞成分的有效方法，因此我们认为脱细胞作用也可以去除ON中的某些抑制性成分，同时保留了一些不溶的促进轴突生长的细胞外基质（ECM）蛋白。
在这项研究中，作者使用大鼠背根神经节（DRG）培养模型制备了成熟猪的脱细胞性视神经（DON），DSN和DSC，并评估了它们对神经突生长的影响，比较了脱细胞前后ON的蛋白质成分，发现DON优化的神经突促进作用与其蛋白质组成的变化高度相关。证明脱细胞处理后，胶原蛋白IV（COL4）和层粘连蛋白（LAM）的生物活性在DON中能很好的保留。结果表明，脱细胞后促进神经突生长的ECM蛋白的选择性保留优化了ON的抑制性微环境。
技术路线
实验结果
1、DON，DSN和DSC中残留DNA的表征
同种异体移植物中的核残基可能在宿主内引起一系列免疫反应，从而导致严重的副作用和受损的组织修复。因此，评估脱细胞作用的最重要任务是定量脱细胞材料中的核残基。
显微镜检查组织切片显示天然组织（NT）的无孔结构和脱细胞组织（DT）的多孔结构（图1A和B），脱细胞处理后组织切片中没有核染色（图1B）。在所有DT中，DNA含量均小于50ng / mg（图1C）。在任何DT的凝胶电泳过程中均未观察到DNA信号（图1D）。这些结果表明细胞成分已被有效地从DT中去除。
图1 分析DT中的核酸残基
2、ON的脱细胞促进神经突向外生长
为了评估DT对神经突生长的影响，在纵向组织切片上进行了离体背根神经节（DRG）实验。生长72小时后，将细胞和组织固定，并对神经突进行免疫荧光标记；然后在荧光显微镜下确定神经突的最大延伸距离和分支数（图2A和B）。图2C显示了支路的最大延伸距离和数目如何被定义。从结果来看，在DON和DSC上生长的神经突明显显示出更长的延伸距离。结果表明，脱细胞作用可以促进DRG神经突在包括ON和SC在内的中枢神经组织上的生长。虽然原始的ON切片不是神经突生长的理想基质，但一些神经突(图2D中的白色箭头)仍然能够沿着神经纤维束区域(图2D中的白色星号)之间的结缔组织隔生长。这表明与神经纤维束区域相比，ON的结缔组织隔可能含有支持神经突延伸的某些成分，或缺少某些抑制神经突生长的成分。
图2 不同组织基质对DRG神经突生长的影响
3、DON对神经突取向和神经元附着的影响
为了进一步验证DON在神经突延伸方向中的作用，我们在DT（DON，DSN和DSC）和NT（ON，SN和SC）的切片上植入了分离的DRG神经元。孵育72小时后，我们观察到，与NT切片（图3A1-3，箭头）相比，DT切片（图3A1'-3'，箭头）附着了更多的DRG神经元。我们通过测量NF阳性神经突与组织切片纵轴之间的角度来量化生长取向（图3B）。DON切片上偏离角度为0°–30°的神经突所占比例大于DSN切片和DSC切片（图3C）。这表明与其他DTs相比，DON对神经突生长具有更强的定向作用。此外，我们通过计算神经元密度来评估不同组织切片上的细胞粘附性，神经元密度是在0.5mm×0.5 mm区域内被NF和Hoe双重标记的神经元数量（图3D）。DON和DSC组的神经元密度显着高于ON和SC组（图3E）。DSN和SN组之间的NF阳性细胞数量上没有显著差异（图3E）。
图3 DRG神经元的存活和神经突生长
4、ON的脱细胞主要保留促进神经突生长蛋白
与NT相比，DT上神经突的不同生长行为可能是由于脱细胞过程引起的蛋白质组成变化所致。因此，对所有三种DT进行了蛋白质组学分析，并比较了DON，成熟视神经（MON）和胚胎视神经（EON）组中每组所有三个重复序列中检测到的蛋白质成分的变化。从DON，DSN和DSC组中筛选了ECM蛋白，并使用维恩图（图4A）可视化了它们的设置关系。脱细胞后，ON丢失了1161个蛋白质（图4B），其中仅丢失了9种ECM蛋白（图4B）。这表明ECM蛋白在脱细胞过程中被选择性保留，而细胞内蛋白被去除。斑点印迹检测两种普遍存在的ECM成分（COL4和LAM）进一步证实了这些结果。与MON相比，发现DON和EON中COL4和LAM的浓度均增加（图4C）。如图4D所示，脱细胞后观察到不同ECM蛋白的上调和下调。在标记每个ECM蛋白及其与轴突生长相关的生物学功能后，我们发现大多数(8分之7)生长促进蛋白与轴突延长相关。COL4和LAMB1在ON细胞脱细胞后被保存并富集。相反，大多数(7分之5)的抑制轴突延伸蛋白在脱细胞后水平较低(图4E)。
图4 不同DTs的蛋白质组学分析以及ON和DON组织结果的比较
5、DON中的COL4和LAM保留生物活性以支持神经突生长
为了验证脱细胞后保留的基质蛋白的功能活性，我们选择COL4和LAM作为测试蛋白，因为它们在促进神经再生方面具有已知的活性。图5A显示了对照组中DON切片上DRG神经突生长的状态。具有不同半径的红色虚线表示用于确定交叉点的定量方法（图5C）。使用了针对COL4或LAM的抗体来阻断DON中这些蛋白质的功能。随着抗体浓度的增加，DON中的神经突在长度和密度上降低，COL4或LAM重新引入培养环境可恢复DON中DRG的神经突生长活性（图5B-D）。这些结果表明，DON中保留的COL4和LAM都在支持神经突生长中发挥作用，且LAM比COL4更能支持神经突生长。
图5 COL4和LAM支持DON中神经突的生长
6、DON中保留的COL4和LAM可以与ITGA1结合
由于脱细胞涉及物理性震荡，化学溶解和酶促分解，可能会破坏蛋白质结构，因此尚不清楚DON中保留的ECM蛋白是否可以通过结合其蛋白伴侣发挥功能。整合蛋白在神经元细胞膜上的分布和激活已被证明在成功的轴突再生中发挥重要作用，而COL4/LAM与ITGA1的相互作用被认为可以促进交感神经元的轴突生长。免疫染色显示，COL4和LAM在DON中明确表达(图6A)。在将DRG接种三天后，我们观察到DON切片中神经突沿ITGA1的点状表达（图6B）。这些结果证实了ITGA1在介导DRG神经突生长中的重要作用。随后，我们以ITGA1为诱饵，利用Co-IP技术研究了DON-DRG培养体系中ITGA1与其ECM蛋白(COL4和LAM)的相互作用(图6C)。我们的结果显示COL4和LAM都与ITGA1相互作用，如图6D所示。
图6 DON-DRG培养系统中COL4或LAM与ITGA1的相互作用
小结
在本研究中，发现脱细胞作用可以优化成熟视神经在支持背根神经节（DRG）神经突定向生长方面的功能。在DON上生长的神经突比在ON上生长的神经突具有更长的延伸距离。与ON相比，DON上的神经突分支也显着增加。脱细胞作用能选择性去除了一些轴突抑制分子，例如髓鞘相关糖蛋白和硫酸软骨素蛋白聚糖，并保留了一些轴突促进的ECM蛋白，包括COL4和LAM。此外，显示COL4和LAM在DON中被保留，并且它们与整合蛋白ITGA1的结合活性被保留以促进DRG神经突的延伸。总之，这些发现为优化中枢神经组织轴突抑制微环境提供了可行途径，并为DON支架在中枢神经损伤修复中的应用奠定了理论基础。