蛋白酶解的首选变性剂——RapiGest SF
贾伟
沃特世科技（上海）有限公司实验中心
在生物药肽图分析、蛋白质修饰分析、蛋白质组学研究等诸多工作中，蛋白质的变性与酶解是样品处理的必经之路。RapiGestTM SF正是在这个实验步骤中，用以辅助蛋白酶解的变性试剂[1,2,3]。RapiGest SF有以下优点：
■ 综合水相、有机相溶液条件下，最高效的辅助酶解变性剂。
■ 作用过程中，不对蛋白造成副反应化学修饰。
■ 操作简单、全面适应液质分析方法。
■ 常规操作浓度对胰蛋白酶活性无抑制。
■ 可大大缩短酶解反应时间。
■ 对各种蛋白酶、肽-N糖苷酶等多种酶解过程都适用。
在蛋白质质谱分析的大部分工作中，常常需要将蛋白质酶解为多肽进行分析。但蛋白质结构是以三维结构的形式存在的，为了将蛋白高级结构内部的酶切位点暴露于蛋白酶的作用下，首先需要对蛋白进行变性，使蛋白舒展开。John R. Yates教授领导的团队对各种变性剂中的辅助酶切效果进行了充分比较，其中RapiGest SF的表现最为优秀（图1）[4]。仔细观察图1还可以发现，在实验结果中，较为常用的尿素辅助酶切效率较差。这是由于尿素对胰蛋白酶活性的抑制作用较大。实验人员有时会采取使用尿素进行蛋白后，将反映溶液稀释10倍，再加入胰蛋白酶的方法，以降低尿素浓度到1M以下，减少其对胰蛋白酶的抑制。但是，面对微量的生物蛋白样本，稀释后的体系，会大幅度降低样品浓度，限制了后续的分析工作。此外，尿素在对蛋白变性的过程中，还会对蛋白进行一定的化学修饰，如氨基甲酰化。副反应的发生对于多肽鉴定、组学水平蛋白定量会造成一定的影响与误差。而使用RapiGest SF无副反应的问题，正常使用浓度下(0.1%)对胰蛋白酶活
性也无影响（表1）。
图1. Tris水相缓冲体系下各种变性剂的辅助酶切效果比较。样品为mammalian cell lysate cytoplasmic fraction蛋白。
检测基于胰蛋白酶诱导N-α-苯甲酰-L-精氨酸乙基乙酯（BAEE）水解。将0.5微克胰蛋白酶加入1mL 50mM的碳酸氢铵溶液中（pH 7.9，0.2 mM BAEE）。检测△BAEE在253 nm下的吸收值（5分钟内的斜率）。
RapiGest SF虽然是一种表面活性剂，但其全面适应液质分析的要求。在使用RapiGest SF作为变性剂完成蛋白酶切后，如果只进行色谱分析，则可无需对RapiGest SF进行处理。如进行液质联用分析，则通过简单的加酸步骤就可将RapiGest SF去除。而酸性溶液环境又恰恰是液质分析所需的样品溶液环境。事实上，RapiGest SF是酸性不稳定表面活性剂，在酸性条件下（pH2）极易水解。RapiGestSF的结构及其水解产物见图2。酸化后RapiGest SF降解为两个产物：2-十二酮和3-羟（2,3-二羟基丙基）丙磺酸钠。前者与水不能互溶，通过离心去除。后者在水溶液中溶解度很高，在反相LC模式下不保留。因此，酶消解后的水溶液可直接进行LC-MS或MALDI-MS分析。
图 2. RapiGest SF在酸性溶液中的降解产物。
图3为Ra piGest SF辅助的人单抗酶解的实例。通过BiopharmaLynxTM软件分析，其序列覆盖度为98%。而且LC/MS
分析中没有发现错误酶切的多肽或完整未被酶切的蛋白。2%序列未发现的原因是由于此部分序列为2个氨基酸的超短肽或单个氨基酸（R或K），其无法在反相柱上保留。
图 3.LC-MS分析RapiGest SF辅助下的人单抗胰蛋白酶酶解多肽。
由于其表面活性剂的属性，RapiGest SF可以非常快速地对蛋白完成变性，从而缩短酶解实验时间。图4显示，RapiGest SF辅助下，完全酶解马肌红蛋白只需要5分钟。而由于肌红蛋白属球蛋白，其在不充分变性的情况下将难以酶解。在对照反应中，单纯与胰蛋白酶孵育条件下，即使到9小时后，仍只有少量的蛋白被酶解；而使用了RapiGest SF试剂的体系，酶解效率显著提升。
图 4.有无RapiGest SF辅助下，马肌红酶解效果对比。
RapiGest SF自2002年推出以来，已经过10年的使用，它良好的性能被广泛认可，对各种蛋白酶、肽-N糖苷酶
等多种酶解过程都适用[5]。RapiGest SF已经成为大部分生物质谱科学家的常规必备试剂。
参考文献
(1) Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC. Enzyme-friendly,mass spectrometry-compatible surfactant for in-solution enzymatic digestion of proteins. Anal. Chem. 2003, 75, 6023-6028.
(2) Huang HZ, Nic hols A, Liu DJ. Direct identification and quantification of aspartyl succinimide in an IgG2 mAb by RapiGest SF assisted digestion. Anal. Chem. 2009, 81, 1686-1692.
(3) Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC. A complete peptide mapping of membrane proteins: a novel surfactant aiding the enzymatic digestion of bacteriorhodopsin. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004, 18, 711-715.
(4) Chen EI, Cociorva D, Norris JL, Yates JR 3rd. Optimization of Mass Spectrometry-Compatible Surfactants for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 2007, 6, 2529-2538.
(5) Yu YQ, Gilar M, Kaska J, Gebler JC. A rapid sample preparation method for mass spectrometryc haracterization of N-linked glycans. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005, 19, 2331-2336.
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