乳腺癌是最常见的癌症，在2022年美国癌症协会发表的癌症统计报告中指出，2014年至2018年期间，女性乳腺癌的发病率持续缓慢增长（约每年增加0.5%），而在2022年度女性确诊的癌症中，乳腺癌、肺癌和结直肠癌发病率占所有癌症种类的51%，仅乳腺癌就占近三分之一^【1】。

乳腺癌通常从导管过度增殖开始，经过各种致癌因素的不断刺激后，再发展成良性肿瘤甚至转移性癌^【2】。乳腺癌的发生和发展机制有两种假设理论：癌症干细胞理论和随机理论。癌症干细胞理论认为，所有肿瘤亚型都来自相同的干细胞或祖细胞，干细胞或祖细胞中获得性遗传和表观遗传突变将导致不同的肿瘤表型；而随机理论则认为，每种肿瘤亚型都是从单细胞类型（干细胞，祖细胞或分化细胞）开始的，随机突变可以在任何乳腺细胞中逐渐积累，导致它们转化为肿瘤细胞。虽然这两种理论都得到了大量数据的支持，但都不能完全解释人类乳腺癌的发病原因。因此，在体外进行培养的乳腺癌类器官模型能够作为患者的“替身”，在研究致病机理的同时，能够帮助患者预测多种治疗方案的效果，是个性化医疗的有利工具。

本篇文章基于Nature protocols^【3】和Cell^【4】发表的两篇文章，整理了病人组织来源的乳腺癌类器官培养方案。

图1. 病人组织来源的乳腺癌类器官培养方案^【3】

细胞来源

活检样本或手术样本

培养基配方

组织处理

1. 将新鲜乳腺癌组织样本放入预冷的含有1% BSA的DMEM-F12培养基中，剔除脂肪组织和坏死的肿瘤组织（通常为黄色或白色），只选取活的肿瘤组织（通常为粉红色）。

2. 将组织转移到含有5 mL预冷的PBS溶液中清洗，去除血液和碎片。为防止污染，需要多次重复此步骤至液体变澄清。

3. 吸出PBS，加入含有1% BSA的DMEM-F12培养基中。将组织切割为0.5–1 mm³的小块，此步骤可以留存适量组织用于测序、免疫组化分析等。

4. 将剩余组织块切碎，并加入1 ml含有1% BSA的DMEM-F12培养基，用p1000吸头将肿瘤碎片悬浮液转移到含有5 ml解离培养基的离心管中，轻轻震荡混匀后，放置于37℃恒温摇床中震荡解离1-2h，调整转速约为140 rpm。每30分钟将离心管上下颠倒混匀5-10次，并取少量在显微镜下观察。当镜下出现5-10个细胞/簇时，停止解离。

5. 加入1ml FBS终止消化。

6. 将悬浮液经过100μm细胞筛网过滤，收集解离的细胞。

7. 将过滤的细胞悬液在4℃条件下450g离心5min。

8. 若细胞沉淀有明显的红色，则将细胞重悬于5ml的红细胞裂解液中，冰上孵育10min使红细胞裂解。

9. 向细胞悬液中加入5ml DMEM-F12冲洗细胞一次，离心收集细胞沉淀后，加入1-2ml DMEM-F12重悬细胞，并进行台盼蓝染色观察活细胞占比。

类器官培养

10. 将冻存的BME在4℃下过夜解冻，在冰上以200μl:50μl的体积比将BME与细胞悬液混合，轻轻吹打混匀避免产生气泡。

11. 从37℃培养箱中取出预热的12孔板，将100μl混合液接种在各孔中，注意需接种在孔的中心，避免接触侧壁。

12.将12孔板翻转后，室温放置5min；然后转移至37℃，5%CO₂的培养箱中，正置孵育30min，使BME固化。

13. 向每个孔中缓慢滴加 750 µl 预热的类器官培养基，确保基质胶被完全覆盖。放于37℃，5%CO₂的培养箱中培养，每2-4天更换培养基。

类器官传代

14. 吸出类器官培养液，加入2ml预冷的DMEM-F12培养基，机械吹打后加入2 mL TrypLE Express。室温孵育1–5min后，用移液器多次吹打，从基质胶中释放类器官。

15. 用含有10%FBS的DMEM-F12培养基终止消化，在4℃条件下300g离心5min。

16. 用冷PBS清洗后，再次4℃条件下300g离心5min。

17. 将所得沉淀按照1：2-1：8的比例重复10-13步骤（具体比例通过类器官的汇合度确定），完成传代。

类器官冻存

18. 当显微镜下类器官的尺寸达到100-150μm时，可以考虑进行冻存。

19. 取3-4个孔的类器官，消化离心后取细胞沉淀，加入1ml细胞冻存液。

20. 将细胞重悬后转移至冻存管中，利用程序降温盒缓慢降温至-80℃。

21. 第二天，将样品转移到液氮中长期储存。

类器官复苏

22. 将液氮冻存的乳腺癌类器官放置在37℃水浴锅中进行解冻，水浴时间不宜超过2min。

23. 将细胞悬液转移至15ml离心管中，加入10ml预冷的DMEM-F12培养基（含10% FBS）。4℃条件下300g离心5min，取细胞沉淀。

24. 将所得沉淀重复10-13步骤，完成乳腺癌类器官的复苏。

图2. 不同类型乳腺癌来源的乳腺癌类器官形态特征^【3】

乳腺癌类器官应用前景

类器官模型可以有效地反映肿瘤的异质性，并且通过测序结果证实，大多数类器官可以很好地保留来源组织的基因特性。Goldhammer N等人^【5】提供的数据表明，在早期传代中，病灶组织和体外培养类器官之间的相似度最高。在过去的几年中，随着消化步骤的优化和实验技术的不断改进，乳腺癌类器官的培养成功率已提高到~80%，这也将成为进一步研究乳腺癌的有效模型（图3）。

图3.乳腺癌类器官的进化过程^【6】

Cassidy 等人^【7】利用乳腺癌类器官筛选了18种抗癌药，发现了培美曲塞联合卡铂、吉西他滨和吡罗替尼的用药比其他方案对乳腺癌抑制率高出60%；对乳腺癌类器官进行WGS测序，可以寻找出对Olaparib和Nilapali更敏感的高表达BRCA1/2患者。因此，通过对乳腺癌类器官的基因检测和药物检测，扩大了患者的治疗选择范围，也为患者提供了更精准的治疗方案。

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参考文献

【1】Rebecca L. Siegel MPH, et al. Cancer statistics, 2022[J]. CA: a cancer journal for clinicians, 2022, 72(1): 7-33.

【2】Sun Y S, et al. Risk factors and preventions of breast cancer[J]. International journal of biological sciences, 2017, 13(11): 1387.

【3】Dekkers J F, et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids[J]. Nature protocols, 2021, 16(4): 1936-1965.

【4】Sachs N,, et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity[J]. Cell, 2018, 172(1-2): 373-386. e10.

【5】Goldhammer N, et al. Characterization of organoid cultured human breast cancer[J]. Breast Cancer Research, 2019, 21(1): 1-8.

【6】YU, Jin; HUANG, Wei. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells, 2020, 13(3): 295-304.

【7】Cassidy J W, et al. Patient-derived tumour xenografts for breast cancer drug discovery[J]. Endocrine-related cancer, 2016, 23(12): T259-T270.

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