还记得上上周的外泌体经典再读么？还有上周的教你如何寻找肿瘤早期诊断标记物吗？这些都是本期外泌体专题中的一部分哦~本周的外泌体专题讲的是啥呢？
看题目你就知道了吧，今天的主题与肺癌有关，是介绍肺癌早期诊断及转移相关外泌体的筛选、鉴定及分子作用机制研究！怎样，是不是很专业~下面跟着小编一起来看看研究方案是如何设计的吧！
研究目标
1：通过外泌体内容物的测序，对非小细胞肺癌进行早期诊断；
2：通过非小细胞肺癌血液等循环体液的外泌体研究，发现非小细胞肺癌转移，复发，耐药等相关分子机理；
样品选择
一：细胞系选择
人肺癌细胞株：A549 ,H1299,SK-MES-1,H292,H1650,95D
正常支气管上皮细胞株：HBE
人肺泡上皮细胞株：HPAEpiC
此次选择覆盖了非小细胞肺癌的大多数的细胞类型，同时也覆盖了相应用于后期机制研究的细胞类型，能对后期的研究的覆盖度有个良好的保障，每种细胞类型，选择三个重复样。
二：非小细胞肺癌亚型的病例研究
在确定兴趣非小细胞肺癌亚型时，建议选择3～5个患者，进行血液外泌体测序
三：biomarker研究：大规模临床样本验证
选择早期的肺癌病人，其他病例，正常人病例，肺炎等100-200例，使用茎环qPCR的方法检测目标miRNA或者micro RNA family，大量数据验证相关性。
技术路线
图1 研究思路
分析方案
由于外泌体的RNA目前的研究集中在“biomarker”和机制研究这俩个方向，下面详细论述：
一：“Biomarker”研究：
1：首先通过大规模的细胞上清外泌体筛选出特异的miRNA；
2：实际的病例血液样本中，筛选出外泌体中的miRNA；
3：将step1,step2当中得到数据取交集（根据miRNA 或miRNA family），得到特异的与早期肺癌发生相关的miRNA。
4：其中需要检测相关miRNA与早期肺癌患者基因组之间的关联性，确定外泌体miRNA能够做为相关早期肺癌相关性的依据（这一过程较为复杂，可能需要反复结合之前的数据）
5：大临床样本验证，其中样品选择已在上文提及。
二：机制研究机制研究目前主要放在外泌体LncRNA，protein，smallRNA等，早期的肺癌研究，个人建议主要放在，早期癌症的发生，恶化，转移等方向；建议参考Cancer-Secreted miR-105 Destroys Vascular Endothelial Barriers to Promote Metastasis一文。
实验验证方案
1.qPCR验证相关miRNA/LncRNA表达情况：验证miRNA/LncRNA在相关细胞上清液的表达情况，验证测序结果的可靠性；
3.外泌体功能研究：收集实验体系中的外泌体后，将外泌体加入细胞中进行共培养实验，观察不同外泌体对细胞状态（细胞凋亡、增殖等）的影响；
4.外泌体miRNA功能研究：确定外泌体中重要的miRNA/LncRNA后，可直接对miRNA/LncRNA进行功能研究，通过过表达或抑制miRNA/LncRNA的表达观察miRNA/LncRNA对细胞功能的影响；
5.外泌体miRNA/LncRNA靶基因功能验证：对已验证的miRNA的靶基因使用siRNA抑制或过表达对功能进行验证，进一步证明miRNA是通过这些靶基因发挥功能；
生物信息学分析介绍
以下对重要的生物信息分析举例说明：Pathway-network的关联网络图
信号通路(pathway)注释和信号通路富集性分析后，我们看到的是孤立的信号通路。然而，体内的信号通路是相互联系的，一个信号通路的激活将会引起其他信号通路的激活。
图2 关联网络图
本期思路解析就说到这里了，有没有对你的科研思路有所启示呢？下期小编会继续为大家深挖外泌体相关的研究思路，记得来学习哦~
文中提到的文章，有需要原文的也可以向小编索要，没办法，就是介么大方~
