编者按
贯叶连翘，又名贯叶金丝桃、圣约翰草St. John Wort，是药用植物中的明星物种，其制剂常被用作抗抑郁症、失眠、酒精依赖综合征等病症的临床用药。然而，其潜在毒性及其药理活性的多样性机制研究目前还不完善。
今天，我们分享2022年发表在《Front Pharmacol》的一项研究成果——Hypericum lanceolatum Lam.Medicinal Plant: Potential Toxicity and Therapeutic Effects Based on a Zebrafish Model，该研究利用斑马鱼模型，研究了药用植物贯叶连翘的潜在毒性及其多效性，包括对氧化应激、组织再生、雌激素样效应、神经生成和代谢紊乱的影响等，验证了贯叶连翘的抗氧化、促再生、抗脂质积累和促神经生成效果，因此，这种传统药用植物作为预防和/或治疗代谢紊乱的潜在替代品，具有很大的市场开发前景。
文章题目
Hypericum lanceolatum Lam.Medicinal Plant: Potential Toxicity and Therapeutic Effects Based on a Zebrafish Model
杂志：Front Pharmacol
发表时间：2022年3月11日
作者：Laura Gence, Danielle Femezelian, et al．
01、研究背景
这篇文章主要研究了药用植物贯叶连翘的多效性。研究工作的目标是：1.确定该植物水提取物在体内的潜在毒性;2.利用几种斑马鱼模型，研究其可能的生物学特性，包括对氧化应激、组织再生、雌激素样效应、神经生成和代谢紊乱的影响。
研究首先通过液相色谱-串联质谱对植物的多酚组成进行了测定，鉴定出绿原酸异构体、槲皮素和山柰酚衍生物作为主要化合物。然后，研究首次评估了贯叶连翘水提取物的毒性，并根据经济合作与发展组织（OECD）的指南，在斑马鱼胚胎发育的0至96小时后（hpf）确定了最大非毒性浓度（MNTC）。这个MNTC测试也在孵化后的胚胎上进行了2天处理（3至5天发育后，dpf）。
在EASZY实验中，研究支持了贯叶连翘的抗雌激素效应。在尾部截断模型中，研究表明贯叶连翘在其MNTC水平下表现出抗氧化特性，促进免疫细胞的募集和组织再生。研究结果还突出了其在代谢紊乱中的有益效果，贯叶连翘能有效地减少过度喂养的幼虫和成年模型中的脂质积累和体重指数。此外，研究表明贯叶连翘没有改善高血糖斑马鱼模型中的空腹血糖水平，但令人惊讶的是，它抑制了糖尿病条件下观察到的神经生成障碍。
总之，这项研究强调了贯叶连翘在体内的抗氧化、促再生、抗脂质积累和促神经生成效果，并支持将这种传统药用植物作为预防和/或治疗代谢紊乱的潜在替代品。
02、主要研究结果
1. 水提取物中的总多酚含量
通过改良版的Folin-Ciocalteu比色法，使用96孔微孔板技术对贯叶连翘水提取物的总多酚含量进行了测定，结果以每克干重的没食子酸当量(GAE)表示。
实验中，贯叶连翘水提取物与稀释的Folin-Ciocalteu试剂和碳酸钠溶液混合后，在50°C下孵育5分钟，随后冷却并测量760nm处的吸光度。贯叶连翘草药茶在传统医学中被用于减少炎症和糖尿病，其水提取物的多酚含量测定显示，每克干重含有103.2 ± 6.1 mg GAE，这与其作为多酚类生物活性分子来源的描述相符。
2. 体外DPPH自由基清除活性
贯叶连翘水提取物的化学抗氧化能力通过DPPH方法进行评估，使用抗坏血酸作为阳性对照，并计算了“IC50-like”值来表示抗氧化能力。
实验结果显示，其DPPH实验的“IC50-like”值为0.86 ± 0.1 g/L，是抗坏血酸的约1/10。尽管DPPH实验不具有药理学相关性，但提供了贯叶连翘水提取物具有潜在抗氧化化合物的证据。
3. 多酚鉴定与定量
采用超高效液相色谱-串联质谱技术，对贯叶连翘水提取物进行了多酚类物质的鉴定和定量分析。通过LC-MS/MS分析，鉴定出贯叶连翘含有23种多酚类化合物，包括酚酸和黄酮醇，其中咖啡酰奎宁酸异构体(绿原酸)、槲皮素苷和山柰酚苷是主要的多酚成分。
定量分析显示，贯叶连翘中咖啡酰奎宁酸异构体的含量高达83.4 mg/g干重，占已鉴定总化合物的65%。采用标准物质制备校准曲线，通过线性回归计算确定了分析物的浓度，并以mg/g干重的形式表达。实验结果表明，贯叶连翘水提取物富含多种多酚类化合物，具有潜在的健康益处。
图1
4. 鱼胚急性毒性试验
根据OECD指南236，通过Fish Embryo Acute Toxicity (FET)测试对贯叶连翘水提取物的毒性进行了评估，选用不同浓度处理新受精斑马鱼胚胎至96小时后，并观察胚胎发育情况。实验中，每天对胚胎进行显微镜下的分析，评估凝血、体节形成、尾部分离和心跳等指标，以及观察形态畸形和孵化情况。在3天斑马鱼幼体上进行了额外的毒性测试，以排除胚胎期毒性，并在2天内分析了幼体的生存率和形态缺陷。
在0.3125 g/L浓度下，未观察到胚胎和幼体的形态畸形或死亡率，因此将此浓度定义为最大非毒性浓度（MNTC），并用于后续研究。为了进一步验证MNTC的非毒性效果，对贯叶连翘水提取物进行了基因表达分析，包括肝毒性、心毒性、肾毒性标志物以及受糖皮质激素调控的基因。
使用3至5天斑马鱼幼体进行的RT-qPCR分析显示，MNTC处理2天并未显著诱导肝毒性、心毒性、纤维化和内分泌干扰标志物的表达。同时，对转基因tg(GFAP::GFP)斑马鱼幼体进行了研究，该转基因幼体的神经干细胞表达GFP，贯叶连翘提取物处理后，GFP荧光强度在脊髓水平没有变化。这些结果支持了贯叶连翘水提取物在MNTC浓度下的安全性，并为进一步的生物学效应研究提供了基础。
图2、3
5. 内分泌活性物质检测
为了评估贯叶连翘潜在的雌激素活性，根据OECD TG 250指南，使用EASZY检测法对新受精的cyp19a1b-GFP转基因斑马鱼幼体进行了处理，并在28°C的孵化器中从0至4天斑马鱼幼体发育阶段( dpf)进行暴露。
实验中，每天更新介质，使用不同浓度的贯叶连翘水提取物处理幼体，并与阴性对照(养殖水)和阳性对照(17α-乙炔雌二醇EE2 0.05纳摩尔)进行比较。暴露结束后，收集转基因斑马鱼幼体进行荧光成像分析，每次测试条件分析26至38个幼体，共进行了两次独立实验。
在第三次实验中，评估了单独的雌二醇(E2)暴露或与贯叶连翘共暴露(0.156 g/L)对幼体的影响。实验结果显示贯叶连翘水提取物以浓度依赖性方式下调了基础GFP表达，而阳性对照组观察到GFP表达的显著上调，验证了实验的有效性。进一步的共暴露实验表明，贯叶连翘水提取物能显著降低E2诱导的GFP表达，证实了其对雌激素受体依赖性cyp19a1b基因表达的负向干扰能力。
目前尚不清楚贯叶连翘抗雌激素效应的确切机制，如酚类化合物是否作为拮抗剂结合到雌激素受体，或者是否激活了导致与雌激素信号通路负向串扰的信号通路。所有实验都经过有效性标准的检查，以确保测试结果的准确性和可靠性。
图4
6. 对斑马鱼进行行为分析
根据先前研究推荐，为了更好地评估运动能力，选择6天斑马鱼幼体进行运动行为分析，并使用Viewpoint Zebrabox系统进行监测。
3天大的斑马鱼幼体开始被孵化在E3培养基（对照组）或贯叶连翘水提取物的最大非毒性浓度（MNTC，0.3125 g/L）中，每天更换处理液，持续3天。在6天时，幼体经过10分钟适应期后，在暗环境中记录10分钟内的不活动、小活动和大活动状态。
实验结果显示，对照组和处理组幼体在不活动、小活动、大活动和总移动距离上没有显著差异。这些结果表明，在MNTC浓度下贯叶连翘水提取物对斑马鱼幼体的运动行为没有影响，揭示了MNTC没有神经行为毒性。该实验作为对MNTC缺乏毒性的最后验证，监测了水提取物对幼体运动行为的潜在影响，确认了MNTC的安全性。
图5
7. 断尾再生氧化应激、免疫细胞募集和组织再生研究
成年斑马鱼和3天斑马鱼幼体首先使用0.02%三卡因(MS-222)进行麻醉，随后进行尾部截断手术。成鱼尾部截断至总尾长的50%，幼体则在不损伤脊索的情况下，在脊索附近进行切割。
在成年斑马鱼上进行了氧化应激实验，使用DCFH-DA和DHE荧光探针检测氧化应激反应，贯叶连翘水提取物预处理显示了抗氧化特性。3天斑马鱼幼体用于免疫细胞募集实验，贯叶连翘水提取物处理显著增加了损伤部位的Mpo阳性中性粒细胞和Lcp1阳性巨噬细胞数量。
成年鱼和幼体在尾部截断后使用贯叶连翘水提取物处理，连续观察14天和7天，监测再生过程。贯叶连翘水提取物在成年斑马鱼和幼体中显示出促进组织再生的特性，特别是在炎症反应和再生过程中的调节作用。通过与地塞米松的共处理实验，揭示了贯叶连翘可能作为炎症过程的调节剂。地塞米松单独处理抑制了尾部再生，而贯叶连翘的存在则改善了这一效果，表明贯叶连翘对炎症反应的调节作用。
实验结果表明，贯叶连翘水提取物通过促进抗氧化反应和免疫细胞浸润，改善了损伤部位的愈合。综合结果揭示了贯叶连翘水提取物在组织再生中的益处，证实了其加速尾部再生的潜力，为贯叶连翘的体内抗氧化和抗炎效果提供了实验依据。
图6-9
8. 代谢性疾病相关的病理紊乱
成年斑马鱼通过在111 mM的D-葡萄糖溶液中浸泡14天来诱导高血糖状态，贯叶连翘水提取物以MNTC(0.3125 g/L)处理，以探究其对高血糖的潜在影响。
实验中，斑马鱼被分为正常饲养组和高脂饮食(DIO)组，以及高脂饮食补充贯叶连翘水提取物(DIO + HL)组，通过不同的饲养方式来模拟肥胖模型。在成年斑马鱼的DIO模型中，贯叶连翘水提取物处理显著降低了BMI，并且似乎减轻了体重，显示出“抗肥胖”的特性。
在慢性高血糖模型中，贯叶连翘水提取物未能降低由高葡萄糖环境引起的血糖升高。慢性高血糖减少了神经干细胞(PCNA阳性细胞)的数量，表明高血糖可能损害了神经发生。7天斑马鱼幼体被分为正常饮食组、高脂饮食(HFD)组和高脂饮食补充贯叶连翘水提取物(HFD + HL)组，使用不同的饲料来诱导肥胖，并用油红O(ORO)染色检测脂肪含量。
实验结果显示，贯叶连翘水提取物处理的幼体相对于过度喂养的幼体显示出显著减少的ORO染色，表明贯叶连翘可能具有减少脂肪积累的效果。贯叶连翘水提取物处理能够防止慢性高血糖导致的神经发生减少，显示出对神经生成的保护作用。这些实验结果表明贯叶连翘水提取物可能对代谢性疾病相关并发症具有积极影响，具有潜在的抗肥胖和神经保护特性。
图10-12
03、编者点评
本文首次报告了使用可靠的斑马鱼毒性测试来评估贯叶连翘水提取物的毒性。分析结果表明，贯叶连翘提取物中含有酚酸（绿原酸异构体）和黄酮类化合物（槲皮素、山柰酚衍生物）作为主要成分。研究表明，贯叶连翘在最大非毒性浓度(MNTC)下对斑马鱼具有强大的抗氧化、促再生、抗脂质积累和神经生成特性。
此外，研究结果显示贯叶连翘水提取物可能对抗糖尿病和肥胖相关并发症具有潜在效果，是提供贯叶连翘非毒性和潜在治疗效果证据的第一步。为了阐明传统药用植物在预防和/或治疗代谢性疾病中的活性机制，需要进一步的研究，使用临床前啮齿动物模型。最后，考虑到贯叶连翘的抗雌激素效应，在怀孕或雌激素依赖性疾病的情况下需要特别注意。
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