Everybody，看过来，今天小编要给大家推送一个深度好文，解决大家在植物RNA提取方面遇到的问题。这可是我们公司有三年RNA提取经验的妹纸的精华大作，好好学习前辈们的经验，你绝对会受益无穷~

植物组织成分相对于动物组织来说复杂多样，因此其RNA的分离和纯化的难度也随之加大，如果要完美的数据结果，那么提取纯度高、完整性好的RNA就成了关键所在。

植物RNA的提取一般会经历以下几个过程：

1.破碎细胞壁

2.裂解细胞膜

3.杂质去除，包括：DNA、蛋白质、多糖、多酚、次生代谢产物等

4.纯化和浓缩RNA
而在RNA提取过程中，纯化除杂的过程是影响RNA纯度的关键所在。在完整的细胞内，多糖多酚类化合物，次级代谢产物，蛋白质如RNase等与核酸是分离的，一旦细胞破碎，这些物质就不可避免的会与RNA发生相互作用。下面我们一起来看看ＲＮＡ纯化过程中会出现的4类问题以及相应的应对策略↓↓↓

问题与策略

植物总RNA的纯化包括以下4个方面：
一、酚类物质的纯化
Question：
植物组织中果实部分以及树木类植物中富含酚类化合物，其会随着植物器官的增长而增加，此外针叶类植物中所含有的酚类化合物要比落叶植物的叶子中更多。植物组织经破碎处理后，释放酚类物质，随后酚类物质被氧化，氧化后的处理液逐渐变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一过程被称为褐化效应，而酚氧化后形成的醌能与RNA结合，导致RNA活性丧失，而用苯酚、氯仿抽提时，RNA还会丢失或形成不溶性复合物，从而影响RNA的分离纯化。
Answer：
1.植物组织采集过程中应尽可能采集幼嫩组织，对组织进行冷冻保存，并在短时间内提取RNA；对于采集回的样品如要长期保存，应经液氮处理后储存在-80℃冰箱，且在样品与裂解液接触前，应防止冷冻的样品解冻，否则酚易被氧化成醌。
2.为防止多酚氧化，在裂解样品的同时可以加入适量的抗氧化剂。
PS：β-巯基乙醇是个不错的选择，它可以抑制氧化反应；
Plant RNA isolation aid （Ambion, AM9690）也是个不错的选择。
Notice：如果植物是茶类、紫荆类，推荐一款不错的试剂盒— RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根，DP441），这些都是妹纸在实验中摸索出来的哦~

二、多糖类物质的纯化
Question：
多糖作为植物细胞的结构组成和营养物质在植物细胞中大量存在，它是干扰植物RNA提取的主要因素，它的许多理化性质与RNA相似，因此很难将它们分离。另外多糖可与RNA结合形成胶状物质，这不但影响实验的操作，而且可以通过引起酶的活性中心改变或必需基团的改变而抑制酶的活性，严重影响分子生物学实验的后续工作。（莫慌，你都看到这里了，小编自然不会亏待你，策略在下面哦~↓↓↓）
Answer：
1.在常规的提取方法中，通过盐酸胍处理可以去除部分多糖；在高浓度Na+或K+存在条件下，通过苯酚、氯仿也可以除去一些多糖；此外还可以通过LiCl沉淀RNA，将部分多糖保留在上清液中，但该法易丢失miRNA。但即使通过这些方法仍会有相当大一部分多糖与RNA缠绕在一起难以分离，所以需要更有效的解决方案。
PS：如果组织样品属于淀粉含量较高的植物样品，如马铃薯、甘薯的块茎、香蕉等，推荐：RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根，DP441），如果是苹果、桃子、樱桃、番茄等普通的多糖类植物，推荐使用：TRK-1001（LC-bio）。

三、蛋白质纯化

Question：

RNase和多酚氧化酶都属于蛋白质，要想获得高质量、完整的RNA，必须对有蛋白质污染的样品RNA进行纯化操作。

Answer：

1.裂解液中加入蛋白质变性剂，如异硫*酸胍，2-巯基乙醇，SDS等可去除大部分蛋白质。
2.可以利用蛋白酶K降解蛋白质，最后再用苯酚/氯仿除去残留的蛋白质或是直接利用TRK-1002试剂盒对RNA进行后续的纯化工作。

四、次级代谢产物的纯化
次生代谢产物是指某些生物利用某些初生代谢产物为原料，在一系列酶的催化下，形成一些特殊的化学物质，这些化学物质即为次生代谢产物，这是一类非生长所必需的小分子有机化合物，但对于植物自身在复杂环境中的生存和发展起着不可替代的作用，如生物碱、黄酮类、萜类、有机酸、木质素等。

PS：因不确定这些代谢产物具体是什么物质，目前还没有特别好的方案来解决这一问题，不过大家可以尝试使用选择性沉淀来纯化。

运技术部

袁丹丨文案

yhuang丨编辑

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