DNA甲基化（5mC）可在肿瘤发生的早期被检测到，具有较好的稳定性，是肿瘤液体活检中一个极具价值的标志物。DNA甲基化检测首先要进行甲基转化，常见的分析方法是使用化学品或酶，以不同的方式与甲基化修饰的C及未修饰的C发生反应，从而将两者区分开。目前有两种策略，一种是通过将非甲基化的C转化为U，如重亚硫酸氢盐转化法（BS-Seq）、EM-seq等；另一种是将甲基化的C转化为U，如TAPS等。

表1. 转化技术对比

传统的BS-seq被认为是甲基化分析的金标准，但存在明显的限制：对DNA损伤大，影响模板利用率；非甲基化C转化为T，基因组碱基不平衡；难以区分5mC和5hmC（另一种重要的甲基化类型，区分5mC和5hmC水平具有重要的临床意义）。最近开发的酶学检测技术解决了DNA损伤的问题，但还存在一定局限性，如DNA样本需求量大、不能区分5mC和5hmC等。

为解决上述检测问题，美国宾夕法尼亚大学研究团队在Nature Chemical Biology上发表了题为“Direct enzymatic sequencing of 5-methylcytosine at single-base resolution”的文章。其开发了一种DNA甲基化测序新方法：直接甲基化测序（DM-Seq）。DM-Seq可保持基因组碱基平衡：转化过程中，非甲基化C与5hmC不变，5mC转化为T；完全使用酶法处理：灵敏度高，不损害样本；少量DNA样本就可以在单碱基分辨率下对5mC进行分析，有望应用于液体活检和早期癌症检测等。

DM-seq流程解析：

① 末修加A：待测模板片段化及末修加A；

② 接头连接：DNA片段与耐受胞嘧啶脱氨酶（APOBEC3A）脱氨基作用的接头（含5pyC）连接。常规甲基化接头含有5mC，很容易通过酶脱胺转化为T，因此需要对接头进行修饰（5pyC接头），防止被A3A脱氨；

③ 合成互补链：使用Bst DNA Polymerase合成有利于DNA羧甲基转移酶（CxMTase）活性的半甲基化互补链。半甲基化CpG的存在可提高DNA的羧甲基化效率；

④ 羧甲基化：CxMTase以CxSAM为底物产生5-羧甲基胞嘧啶(5cxmC)保护所有未修饰的C；

⑤ 葡糖基化：β-葡糖基转移酶的葡糖基化作用将5hmC变为5ghmC，保护所有5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)；

⑥⑦单链去除：绿豆核酸酶降解未复制的链（特异性降解单链）；

⑧ 脱氨：A3A脱氨酶仅作用于未受保护的5mC，产生T；

⑨ 测序：5mC测序结果显示为T。

想要直接检测5mC需要满足两个要求：保护基团有效转移至未修饰的CpG；保护新生成的修饰碱基免受A3A介导的脱氨作用。CxMTase以carboxy-S-adenosyl-l-methionine（CxSAM）为底物生成的5cxmC可以抵抗酶促脱氨。使非甲基化C在转化的过程保持为C，最终实现5mC的直接测序。

DM-Seq对5mC的直接检测能够更好地推动表观遗传测序在癌症治疗中的应用，但其中核心酶原料CxMTase无商业化产品，限制了其进一步的发展应用。翌圣紧跟科研前沿，借助翌圣镁孚泰生物ZymeEditor（点击了解更多）酶改造及发酵、纯化工艺平台成为首家DNA羧甲基转移酶（CxMTase，14555ES）商业化产品供应商，并可提供DM-seq全套酶原料，助力新技术研发及转化。

翌圣CxMTase性能展示

低投入量即可高效完成DNA甲基化：

使用CxMTase对含有HpaII酶切位点的DNA模板进行甲基化修饰，该酶切位点受CpG甲基化影响，未修饰模板被切割，甲基化模板不切割；

酶切结果表明在CxMTase投入量为0.31 pmol时，模板DNA未发生切割，酶切完全阻断，表明模板已被完全甲基化修饰。

DM-seq相关产品推荐

参考文献：

[1] Wang, T., Fowler, J.M., Liu, L.et al. Direct enzymatic sequencing of 5-methylcytosine at single-base resolution. Nat Chem Biol (2023). https://doi.org/10.1038/s41589-023-01318-1