克隆是英文“clone”或“cloning”的音译，而英文“clone”则起源于希腊文“Klone”，原意是指以幼苗或嫩枝插条。1963年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克隆（Clone）”的术语，把“克隆技术”带到了人们的视野中。
克隆技术又称为“生物放大技术”，目前应用最广泛的技术为“分子克隆”，又称重组DNA技术，即通过重组技术将目的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生新的遗传性状的技术。
之前小翌给小伙伴们介绍了常规的分子克隆方法，接下来继续带领大家认识一下新的、非常规的分子克隆技术，包括无缝克隆中的Golden Gate技术、Gateway技术、不依赖基因序列和连接反应的克隆方法等等。
Golden Gate克隆技术通过TypeIIS型限制性内切酶（翌圣BsmBI Cat#15203ES、BspQI限制性内切酶Cat#15202ES、FuniCut™ BsaI Cat#15005ES）识别目的序列以外的四个碱基，剪切后获得粘性末端，直接用于目的片段的连接。通过连接酶（翌圣T4 DNA连接酶Cat#10300）连接形成重组质粒，使用转化技术转化至感受态细胞中，由于限制性内切酶的特性，酶切连接后酶切位点不再存在，能达到精确的无缝克隆。Engler等人利用该技术成功连接了9个目的片段，连接率达90%以上。
图1. Golden Gate Assembly克隆原理示意图【1】
图2. Gateway技术构建表达载体【2】
基本操作流程如下：
图3. SLIC法构建表达载体的步骤【3】
其具体的操作步骤是，利用PCR技术在目的片段两侧分别加上20-25 bp的同源序列，用DpnI酶（翌圣FuniCut™ DpnI Cat#15052ES）消化处理，组装片段按合适的比例混匀，加入大肠杆菌细胞裂解物，37℃反应1 h，然后直接转化大肠杆菌感受态细胞，即可实现体外无痕组装DNA。
图4. SLiCE技术【4】
1.Engler C, Gruetzner R, Kandzia R, et al. Golden Gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIS restriction enzymes. PLoS ONE, 2009, 4(5): E5553.
2.林春晶, 韦正乙, 蔡勤安等. 几种植物转基因表达载体的构建方法[J].生物技术, 2008(05): 84-87.
3.张阳璞, 杨淑慎. 几种新型植物基因表达载体的构建方法[J].生物工程学报, 2015, 31(03): 311-327.
4.杨发誉, 杨云彭, 霍毅欣. 合成生物学中不依赖限制性内切酶的分子克隆策略[J].中国生物化学与分子生物学报, 2018, 34(04): 364-370.