注意:对ATP酶/GTP酶反应,ATP和GTP的浓度应< 0.25mM。如果ATP或GTP浓度>0.25mM,用蒸馏水稀释(比如,ATP酶反应物含有1 mM ATP,检测前加入4倍的水稀释反应混合物)。 3、在每个孔中加入20µL工作试剂。轻敲平板将试剂混合均匀。注意:工作试剂会终止酶反应。 4、在室温下反应30分钟,颜色变深。 5、记录600-660nm (620nm)吸光值。 注意事项 比色皿检测:步骤和96孔板检测步骤一样。不同的是,标准液和样品的量是800µL,工作试剂200µL。 384孔板检测:标准液和样品的量是40µL,工作试剂10µL。 沉淀:磷酸盐浓度很高(>100 mM) 或蛋白质和金属含量高时会发生沉淀。如果出现沉淀,用水稀释样品,直到不会出现沉淀,用稀释的样品重复测试,结果乘以稀释倍数。 酶反应:由于任何外来的磷酸盐会干扰测试,确保酶准备过程中和缓冲液所用试剂不含磷酸盐。 液体处理:检测混合液含有0.4M硫酸,可用等量的NaOH中和废液。 数据分析 绘制标准曲线,通过标准曲线测定样品中磷酸盐的浓度。 论文发表 1. Guérette, D. et al (2007). Molecular evolution of type VI intermediate filament proteins. BMC Evolutionary Biology 2007, 7:164. 2. Green, M.L. et al (2005). Ethylene glycol induces hyperoxaluria without metabolic acidosis in rats. Am J Physiol Renal Physiol 289: F536–F543. 3. Saran, D. et al (2006). Multiple-turnover thio-ATP hydrolase and phospho-enzyme intermediate formation activities catalyzed by an RNA enzyme. Nucleic Acids Research, 34(11): 3201–3208. 4. Adkins, M.W. et al (2007). Chromatin disassembly from the PHO5 promoter Is essential for the recruitment of the general transcription machinery and coactivators. Mol. Cell. Biol. 27: 6372–6382. |